Obtenção e cultivo de células primárias de câncer de ovário humano.

Resumo

O carcinoma de ovário é o mais letal entre os cânceres ginecológicos humanos. A possibilidade de se obter suspensões de células primárias derivadas do câncer de ovário representa um recurso imprescindível para estudos visando compreender a biologia destas células tumorais e desenvolver novas terapias. Células do carcinoma de ovário podem ser obtidas a partir da carcinomatose peritoneal associada ao câncer de ovário ou, ainda, a partir de fragmentos viáveis de tumores de pacientes submetidas à cirurgia. Frequentemente, estas células podem ser expandidas com sucesso por meio de cultura celular de curta duração, o que corresponde a um recurso técnico importante para a obtenção de células tumorais primárias em quantidades suficientes para ensaios laboratoriais. No projeto "Avaliação da atividade antitumoral das células NK e NKT-like contra carcinoma de ovário e possibilidades para o uso terapêutico" suspensões de células neoplásicas primárias derivadas do câncer de ovário serão utilizadas no sentido de se avaliar a função antitumoral de linfócitos CD56+ aultólogos e alogênicos. Descrição dos objetivos.Obter suspensões de células primárias viáveis derivadas do carcinoma de ovário. Determinar a expressão das moléculas HLA de classe I, MIC-A/B e CD155 nas células neoplásicas primárias de ovário. Expandir in vitro e criopreservar as células neoplásicas primárias de ovário. Auxiliar na determinação da citotoxicidade celular mediada por linfócitos CD56+, preparando as suspensões de células tumorais (células alvo). Plano de Trabalho (metodologia, cronograma de resultados previstos)Primeiro bimestre:1.Treinamento e capacitação do bolsista nas técnicas: 1.1.desagregação de tumores sólidos com colagenase;1.2.cultura e manutenção das células tumorais primárias utilizando meio HAM F-10 suplementado com SFB e L-Glutamina;1.3.manutenção das linhagens tumorais K562 e OVCAR3;1.4.Crio-preservação de células utilizando SFB contendo 10% DMSO;1.5.separação de células por meio de colunas magnéticas (sistema MidiMacs, Miltenyi) utilizando anti-corpos monoclonais (anti-CD45) conjugados à "beads"; 1.6.separação de células por meio de centrifugação em gradiente de ficol. 2.Apoio as atividades: 2.1.colheitas de fragmentos tumorais e ascite associada ao câncer de ovário. Segundo bimestre:1.Treinamento e capacitação do bolsista nas técnicas:1.1.citometria de fluxo para determinação da expressão das moléculas HLA de classe I, MIC-A/B e CD155;1.2.marcação de células com CFSE;1.3.elaboração de protocolos para os diferentes ensaios.2.Apoio as atividade:2.1.colheitas de fragmentos tumorais e ascite associada ao câncer de ovário;2.2.determinações da citotoxicidade celular mediada por linfócitos efetores por meio da citometria de fluxo.3.Execução das demais atividades para as quais recebeu treinamento. Restante do período(8 meses):1.Treinamento do bolsista:1.1.análise dos resultados obtidos por meio da citometria (citotoxicidade celular e fenotipagens) utilizando o software FlowJo;1.2.elaboração de tabelas e gráficos para expressar resultados.2.Apoio as atividade:2.1.colheitas de fragmentos tumorais e ascite associada ao câncer de ovário;2.2.determinações da citotoxicidade celular mediada por células NK através da citometria de fluxo.3.Execução das atividades para as quais o bolsista recebeu treinamento. Justificativa para o nível da bolsa solicitada (TT-2)O nível da bolsa de treinamento técnico 2 justifica-se na possibilidade de contemplar um estudante no último ano de graduação em Ciências Biológicas e que disponibilize 16-40h semanais para dedicar-se ao projeto de pesquisa. Justificativa para o Plano em termos dos objetivos do Programa de Bolsas. O plano de trabalho elaborado proporcionará ao graduando em Ciências Biológicas treinamento técnico e vivência em rotinas características de um laboratório dedicado à pesquisa científica, estando, desta forma, adequado as finalidades propostas no Programa de Capacitação de Recursos Humanos da FAPESP.