Prevalência do estado de portador assintomático de meningococo entre estudantes de Medicina da Universidade de São Paulo, Brasil

Resumo

O bolsista de TT trabalhará juntos com os pesquisadores nas seguintes etapas: Isolamento e identificação das cepas de Neisseria meningitidis: Um dos swabs será cultivado em placas sólidas com meio seletivo (Thayer-Martin)10,12 em laboratório até 4h após a coleta11. As placas inoculadas serão incubadas a 35±2ºC em atmosfera úmida, com 5 a 10% de CO2 e examinadas após 24 e 48h. Não havendo crescimento bacteriano, constata-se amostra isenta de neissérias patogênicas. Havendo crescimento de colônias branco-acizentadas, opacas, de aspecto finamente granular e tamanhos variados, redondas com bordas delimitadas ou lobuladas e mucóides, após 48 horas de incubação, constata-se a possível presença de Neisseria spp. As colônias presuntivas de Neisseria spp. serão submetidas a testes bioquímicos complementares de coloração de Gram, oxidase e fermentação ou ausência de fermentação de açúcares como Glicose, Sacarose, Frutose, Lactose e Maltose. A seguir, as amostras indicativas de Neisseria meningitidis serão submetidas à extração de DNA para posterior PCR de identificação molecular com primer específico e serão submetidas à tipagem sorológica para os sorogrupos A, B, C, Y ou W135 por reação de PCR multiplex como descrito posteriormente. As amostras serão ainda analisadas de acordo com o polimorfismo genético por eletroforese de campo pulsado e polimorfismo alélico. Extração de DNA: O DNA genômico dos isolados recuperados será extraído pelo kit IllustraTM Bacteria Genomicprep Mini Spin (GE Healthcare Life Science, USA), de acordo com as instruções do fabricante. Extração de DNA direto de swab: O segundo swab será utilizado para extração direta de DNA de amostra clínica com o intuito de aumentar a sensibilidade de detecção de Neisseria meningitidis por métodos de biologia molecular. A extração de DNA diretamente do swab para PCR será feito através do kit DNeasy Blood & Tissue Kit (QUIAGEN) e padronizado de acordo com Taha et al. Reação em cadeia da polimerase (PCR): a reação de PCR do isolado e diretamente da amostra clínica será feita com primer específico para dois genes característicos de N. meningitidis: ctrA e crgA. A reação será padronizada de acordo com a literatura e os genes ainda serão confirmados por posterior sequenciamento do produto da PCR de algumas amostras (aquelas que diferirem entre si na análise de polimorfismo genético). Ambas as reações (de isolado e amostra clínica) ocorrerão sob as mesmas condições, com mesmos primers e ciclos para comparação posterior. PCR multiplex para tipagem sorológica: a reação de PCR para tipagem dos sorogrupos A, B, C, Y e W135 será realizada nas cepas que obtiverem resultado positivo em PCR de identificação para N. meningitidis. As condições da reação de multiplex e os primers serão utilizados de acordo com Taha et al. Tipagem Molecular por PFGE: os isolados identificados como N. meningitidis através de PCR com primer específico serão submetidos à análise do polimorfismo de seu material genético, DNA, por eletroforese em campo pulsado por digestão do material genômico com enzima de restrição. Será utilizada a enzima SpeI e os parâmetros de corrida eletroforética serão feitos de acordo com o descrito por Lemos et al. (AU)