Efeito de três tipos de bisfosfonatos sobre as moléculas envolvidas na diferenciação e atividade de células clásticas cultivadas sobre diferentes substratos

Resumo

As células clásticas têm como função a degradação de tecidos mineralizados, em eventos fisiológicos e patológicos. Para desempenharem sua função, desenvolvem podossomos os quais contêm filamentos de actina arranjados formando um anel para aderir a seu substrato. A adesão ocorre através da ligação de integrinas ±v²3 da membrana à sequência RGD de proteínas não colágenas da matriz. Na membrana da borda em escova são secretadas enzimas como a fosfatase ácida resistente ao tartarato (TRAP) e íons Cl- e H+. A ATPase vacuolar (V-ATPase) promove a secreção de íons H+, e sua subunidade B2 se liga à actina ao ser direcionada à membrana plasmática das células clásticas ativadas. Os bisfosfonatos são drogas com reconhecida capacidade de inibir a reabsorção de tecidos mineralizados por células clásticas. Os bisfosfonatos não nitrogenados como o etidronato atuam induzindo a formação de análogos tóxicos do ATP. Os bisfosfonatos nitrogenados como o alendronato e ácido zoledrônico impedem a prenilação de GTPases, essenciais ao funcionamento das células clásticas. O objetivo do presente projeto é analisar o efeito dos bisfosfonatos etidronato, alendronato e ácido zoledrônico sobre a expressão de RANK, c-FMS, TRAP, catepsina K e DC-STAMP pelas células clásticas em cultura primária a partir da medula óssea de camundongos por PCR Real Time e a expressão de RANKL e OPG pelas demais células indiferenciadas da medula óssea. Avaliaremos também o direcionamento da subunidade B2 da V-ATPase para a membrana plasmática nas células cultivadas, das quais separaremos as proteínas do citoplasma e da membrana plasmática por ultracentrifugação e faremos análise pelo método Western Blotting. Essas análises serão correlacionadas com o estudo morfológico do processo de adesão e atividade de células clásticas obtidas da medula óssea de camundongos cultivadas sobre diferentes substratos (osso compacto, dentina e esmalte bovinos) em microscopia de luz, eletrônica de transmissão e imunofluorescência. As áreas reabsorvidas serão analizadas por microscopia eletrônica de varredura. Assim, com a aplicação das metodologias propostas, pretendemos compreender o funcionamento de células clásticas frente a diferentes substratos. Ainda, pretendemos através do emprego de bisfosfonatos obter melhor compreensão sobre o mecanismo de reabsorção das células clásticas, bem como o processo de inibição de sua atividade pelos diferentes bisfosfonatos.