Plataforma para geração de uma linhagem celular humana com elevado número de cópias do cDNA relativo ao Fator VIIIDB selvagem e sintético da coagulação sanguínea.

Resumo

A hemofilia A é uma doença genética ligada ao cromossomo X causada pela deficiência do fator VIII da coagulação sanguínea (FVIII). Sua maior incidência é em homens, ocorrendo em 1:5.000 nascimentos, e é caracterizada por hemorragias causadas por traumas ou mesmo espontâneas. Os tratamentos atuais consistem na terapia de reposição com fator VIII derivado do plasma (pdFVIII) ou fator VIII recombinante (FVIIIr). Apesar das vantagens do FVIIIr quando comparado ao pdFVIII, como a impossibilidade de transmissão de doenças virais, o recombinante é caro devido a sua limitada disponibilidade e pouca concorrência de mercado. Além disso, o FVIIIr disponível é derivado de células murinas, apresentando um perfil diferente de glicosilação, o que pode resultar na produção de inibidores quando infundido nos pacientes. Dessa forma, é essencial o desenvolvimento de novas plataformas que reduzam a produção de inibidores e possibilitam altos níveis de expressão da proteína, o que sugere a utilização de células humanas como produtoras do FVIIIr e de um sistema eficiente e seguro de integração do cDNA do FVIIIr no genoma das células. Recentemente, diversos estudos têm mostrado a eficiência do sistema lentiviral em ensaios clínicos. Além disso, o lentivirus permite a múltiplas integrações do cDNA no genoma das células em regiões de transcrição ativas. Assim, a hipótese desse trabalho é que a Biologia Sintética pode fornecer novas moléculas do FVIII da coagulação, com os quais é possível a geração de uma linhagem celular humana portadora de múltiplas cópias do cDNA relativo ao FVIIIDB selvagem produtora de altos níveis da proteína do FVIIIr. Para isso, as células serão submetidas a múltiplos ciclos de transdução com um vetor lentiviral de terceira geração portador do cDNA do FVIIIDB e do gene de resistência neomicina. As células tranduzidas serão selecionadas por meio de tratamento com o antibiótico geneticina. E os níveis de expressão do RNAm e da proteína biologicamente ativa do FVIII serão avaliadas no primeiro, quinto e décimo ciclo de transdução.