Identificação, deleção e caracterização de uma Peroxirredoxina do fungo patógeno oportunista humano Aspergillus fumigatus.

Resumo

Durante os últimos 20 anos, a incidência de infecções fúngicas em seres humanos aumentou consideravelmente, sendo que, o Aspergillus fumigatus, um fungo filamentoso saprófita, é o patógeno fúngico mais prevalente e responsável por doenças respiratórias humanas como a aspergilose bronco pulmonar alérgica e aspergilose invasiva.Em indivíduos imunocomprometidos (como os transplantados e portadores de imunodeficiências) este patógeno é responsável por infecções sistemáticas com altas taxas de mortalidade. De uma maneira geral as infecções microbianas desencadeiam no hospedeiro uma resposta imunológica mediada por espécies reativas de oxigênio (ROS), que incluem os peróxidos orgânicos e peróxido de hidrogênio. A capacidade de microrganismos patógenos manterem-se no hospedeiro sob esse tipo ataque deve-se ao desenvolvimento de mecanismos capazes de protegê-los. Dentre esses mecanismos encontra-se uma série de enzimas antioxidantes para a detoxificação de peróxidos que incluem as enzimas catalases, glutationa peroxidases (GPx) e peroxirredoxinas (Prx). Nesse contexto as peroxirredoxinas tem grande relevância na manutenção do patógeno dentro do hospedeiro, por serem capazes de decompor hidroperóxidos lipídicos e peroxinitritos, além do peróxido de hidrogênio. Todas as Prx contêm um resíduo de cisteína conservado que participa de um ciclo dependente de peróxido para a oxidação, dependente de tiól para a redução durante a catálise. A classificação das mesmas é baseada no número de cisteínas envolvidas na catálise (1-Cys Prx e 2-Cys Prx) e pelo tipo de dissulfeto que é formado durante a catálise: inter ou intramolecular (2-Cys Prx típica ou atípica). A análise do genoma de A. fumigatus utilizando blastx revelou três fases de leitura aberta (ORFs) que apresentam identidade com peroxiredoxina II de humanos: Afu4g08580 (33%), Afu5g15070 (29%) e Afu8g07130 (55%). A análise das ORFs traduzidas destas possíveis Prx sugere que Afu4g08580 e Afu5g15070 são possivelmente 2-Cys Prx, ou seja, com duas cisteínas envolvidas no ciclo catalítico. Curiosamente, as Prx 2-Cys típicas a cisteína peroxidásica ocupa posição mais próxima ao N-terminal (40-50) e, na maioria dos casos, está inserida em um motivo constituído por Val-Cys-Pro (VCP). Entretanto, nas ORFs Afu4g08580 e Afu5g15070 apesar de apresentarem CP em posição semelhante das Prx 2-Cys típicas, a CP está inserida em um motivo Val-Cys-Tre-Tre-Glu (VCTTE), o qual é característico das Prx-1Cys. Em particular, no caso específico da Prx Afu5g15070, alvo de estudos neste trabalho, experimentos de validação bioquímica preliminares desenvolvidos pelo nosso grupo de colaboração, fortalecem a observação de que Afu5g15070 é uma Prx 1-Cys já que ela é capaz de utilizar ascorbato como doador de elétrons.. Este projeto representa uma primeira abordagem para a caracterização do sistema Prx em A. fumigatus. Dessa forma, o presente projeto tem como objetivo avaliar o papel biológico da peroxirredoxina Afu5g15070. Para isso, uma linhagem mutante nulo desse gene será isolada neste trabalho. Adicionalmente o papel do sistema peroxirredoxina na depuração de EROs em A.fumigatus será traçado através do perfil transcricional das três peroxiredoxinas putativas encontradas no genoma de A. fumigatus (Afu4g 08580, Afu5g15070 e Afu8g07130) frente a diferentes agentes que geram estresse oxidativo na célula como, por exemplo, H2O2, peróxidos orgânicos (peróxido de tert-butil), paraquat (metil viologen) e menadiona.