Papel das espécies reativas de oxigênio e ceramidas na morte de neutrófilos humanos induzida por ácidos graxos

Resumo

Neste projeto, estudaremos o efeito dos ácidos graxos na geração de ERO e ceramidas e o possível papel destes segundos mensageiros na ativação de proteínas relacionadas com a apoptose de neutrófilos. Será avaliado o efeito dos seguintes AG: ácidos graxos saturados palmítico e esteárico e o monoinsaturado oleico que são os mais abundantes na circulação, o ácido graxo poliinsaturado n-6 linoléico, que é o principal constituinte do óleo de soja e, portanto, muito abundante na dieta, e os ácidos graxos poliinsaturados n-3 eicosapentaenóico (EPA) e docosaexaenóico (DHA), os principais constituintes dos óleos de peixe que têm enorme aplicação terapêutica. Neutrófilos humanos serão previamente tratados com concentração não tóxica 100 ¼M e tóxica 200 ¼M do ácido esteárico; 250 ¼M dos ácidos oleico, linoleico, palmítico e DHA e 300 ¼M do ácido EPA. Estas concentrações são tóxicas para neutrófilos após 3 horas de incubação. Para estudar os mecanismos envolvidos no processo de morte dos neutrófilos induzido por AG, avaliaremos, por western blotting e por PCR em tempo real, o efeito destes sobre a expressão das proteínas pró e antiapoptóticas (Bcl-xL, Bax e Bim) e sobre as vias de indução da apoptose intrínseca (citocromo c, Smac/Diablo, caspase 9 e caspase 3) e extrínseca (8 e Bid). A participação das caspases 3 e 8 no processo de apoptose será avaliada após tratamento dos neutrófilos com inibidores de caspases. O efeito dos AG sobre a produção de ERO será avaliado por quimioluminêscencia utilizando lucigenina e AmplexTM red. A geração de ceramidas será analisada por HPLC com detector ELSD - (Evaporative Light Scattering Detector). A possível participação das ERO e ceramidas no processo de indução de apoptose pelos ácidos graxos será avaliada por citometria de fluxo na presença de antioxidantes (desferrioxamina e NAC), e/ou na presença de inibidores da geração de ceramidas (Fumonisina B2, 3-O-metilesfingomielina e fantofarona). Esta parte do estudo também será avaliada através da utilização de camundongos Knockout para gp91phox -/- e esfingomielinase -/-. Serão avaliados os seguintes parâmetros de morte celular por citometria de fluxo: viabilidade, fragmentação de DNA, externalização de fosfatidilserina e despolarização de membrana mitocondrial. Neste estudo, também será avaliado o efeito de concentrações tóxicas de AG sobre a fosforilação das proteínas MAP quinases (p38 MAP-quinase, ERK 1/2 e JNK) o mesmo será avaliado na presença de agentes antioxidantes e inibidores da síntese de ceramidas. (AU)