Sinalização celular e molecular em resposta ao estresse genotóxico e/ou geração de dano oxidativo em linhagens de glioma, linfócitos de pacientes com diabetes e Mal de Alzheimer

Resumo

Estima-se que cerca de 2x10000 eventos de dano ocorrem em cada célula por dia, sendo que uma parcela significativa destes é causada por espécies reativas de oxigênio (ROS). A produção excessiva de ROS e/ou o funcionamento inadequado ou ineficiente dos sistemas celulares anti-oxidantes, que neutralizem a ação destes, é conhecido como estresse oxidativo, o qual pode levar à formação de danos nas macromoléculas biológicas (DNA, proteínas e lipídios). O presente projeto apresenta três abordagens:1) O desenvolvimento da Diabetes mellitus tipo 2 depende de diversos fatores de risco, tanto genéticos quanto ambientais. Uma característica desses pacientes é um alto nível de estresse oxidativo, resultante principalmente da hiperglicemia. As consequências da hiperglicemia e as vias de resposta ao dano oxidativo envolvem uma complexa rede de interação envolvendo vários genes. Está sendo proposta uma análise de expressão gênica (PCR em tempo real para genes da via de reparo BER), com enfoque principal relacionado à resposta ao dano oxidativo provocado por altos níveis de glicose em pacientes com Diabetes tipo 2. Os linfócitos de sangue periférico serão coletados antes do tratamento (pacientes com elevada glicemia) e após o tratamento (3 semanas) dos pacientes em regime de internação. Será realizada também a detecção de bases oxidadas no DNA, a 8-oxo-Guanina, por meio do ensaio do cometa. Um estudo paralelo in vitro também será conduzido, para avaliar a indução de dano oxidativo por concentrações elevadas de glicose, pela análise da expressão de genes por PCR em tempo real e imunocitoquímica. 2) A doença de Alzheimer (AD) é uma patologia causada particularmente por danos oxidativos, de risco aumentado a partir dos 65 anos de idade. Com isso, a necessidade da identificação de fatores de risco, além de fatores protetores relacionados à AD, tornou-se de grande importância. O presente projeto visa abordar de uma forma ampla a expressão diferencial de genes envolvidos nas respostas ao dano oxidativo no DNA, com ênfase especial ao processo de reparo por excisão de bases (BER), além do estudo do gene (APOE), identificado como fator de risco genético (genótipo APOE ε4), na forma tardia de AD (esporádica), a mais comum. O projeto visa o estudo desses pacientes AD em estágios moderado e avançado da doença. Ainda, propõe-se analisar, em nível proteico, a modulação de tais genes e avaliar a indução de bases oxidadas (8-oxoG) pelo ensaio do cometa. Esse estudo com enfoque nos níveis de expressão gênica diferencial para uma série de genes-alvo mostra-se relevante para melhor caracterizar a AD, visto que os pacientes provavelmente apresentarão padrões de expressão gênica distinta dos indivíduos controles não-AD. 3) Os tumores de sistema nervoso central, do tipo glioblastoma, são muito resistentes à quimio- e radioterapia. As lesões radio-induzidas são detectadas e processadas por uma ampla rede de sinalização celular, sendo que o gene TP53, pela sua capacidade de transativação, atua no bloqueio do ciclo celular e outros processos relacionados, como o reparo do dano e apoptose, entre outros processos atuando em coordenação. No presente projeto está sendo proposto um estudo das respostas celulares aos danos induzidos no DNA pelo estresse genotóxico causado pela radiação ionizante em níveis de dose elevada, de 2 a 10Gy, em linhagens de glioblastoma proficientes e mutantes para o gene TP53, em função do tempo de coleta após o tratamento, por meio da análise de perfis de expressão gênica por cDNA microarrays complementados por PCR quantitativa em tempo real, testes de citotoxicidade, sobrevivência, apoptose, cometa e imunocitoquímica (para genes específicos). Os dados gerados poderão auxiliar no esclarecimento da interconexão entre os processos fisiológicos de resposta ao estresse genotóxico causado pela RI em tumores de glioblastoma, que geralmente se mostram geneticamente heterogêneos. (AU)