O papel de ATRAP (AT1R associated protein) na modulação de NHE3 mediada por Angiotensina II

Resumo

Angiotensina II é um dos mais importantes moduladores do transporte de solutos e fluidos em túbulos proximais, apresentando um considerável papel na regulação da atividade do permutador Na+/H+ isoforma 3 (NHE3), responsável pela maior parte do transporte transcelular de Na+ nesse segmento tubular. Este mecanismo de modulação é dependente do receptor para AngII, AT1R, caracterizado como um receptor para proteína G heterotrimérica (tipo GPCR, G protein coupled receptor). Postula-se que o mecanismo de ativação de NHE3 por Ang II envolva - como consequência de inibição da adenilato ciclase e redução dos níveis de AMPc secundárias à ativação da proteína Gai por AT1R - a desfosforilação de sítios de serina fosforilados (Ser 552 e Ser 605) por proteína cinase A (PKA).Além desta via, a ativação de AT1R induz também a ativação de fosfolipase C com produção de IP3 e diacilglicerol, aumento de cálcio intracelular e ativação de proteína cinase C (PKC), sendo que a ativação de PKC não parece estar envolvida na modulação de NHE3. Por fim, AT1R ativa também PLA2 com produção de ácido aracdônico, o que poderia desencadear a inibição de NHE3 em doses mais elevadas de Ang II, uma vez que essa via está relacionada com a inibição do transporte de bicarbonato em membrana basolateral de células de túbulos proximais. A ativação de AT1R resulta também em ativação da cascata de MEK/ERK, via importante para a ativação do transporte de bicarbonato em membrana basolateral. Não há evidências de que esta via interfira diretamente com a atividade de NHE3.Recentemente foi identificada uma proteína que interage com a porção carboxi-terminal de AT1R, denominada ATRAP (AT1 - receptor associated protein), e que parece agir como um regulador negativo do receptor, facilitando a sua internalização. A proposta do presente projeto é analisar como ATRAP interfere na modulação da atividade de NHE3 por Ang II e como essa proteína modifica as vias de sinalização desencadeadas pela ligação da Ang II ao receptor AT1R em células de túbulos proximais. Para isso, sempre comparando os efeitos observados em células transfectadas com AT1R com aqueles observados em células transfectadas com AT1R e ATRAP, nós pretendemos analisar os seguintes parâmetros:- Recuperação do pH intracelular após pulso ácido com NH4Cl, desencadeada pela atividade de NHE3. Tal recuperação será avaliada na presença e na ausência de Ang II. O pHi intracelular será medido com a sonda fluorescente BCECF. - Medida dos níveis de AMPc e IP3 intracelular. - Medida da atividade de cálcio intracelular com a sonda fluorescente Fura 2.Além disso, como em alguns experimentos as proteínas recombinantes transfectadas deverão ser marcadas com proteínas fluorescentes, iremos observar a localização de AT1R e ATRAP antes e após estimulação com Ang II em células OKP.