Caracterização da interação entre proteínas não estruturais do vírus da Febre Amarela e eIF3L

Resumo

A Febre Amarela é uma doença causada pelo vírus da Febre Amarela (YFV-yellow fever virus), gênero Flavivirus, transmitido a vertebrados através da picada de vetores artrópodes. O genoma viral origina proteínas virais estruturais e não-estruturais (destaca-se a NS5, proteína mais conservada dentre os Flavivirus e que apresenta duas atividades essenciais durante a replicação viral, uma de RNA Polimerase dependente de RNA e outra de metiltransferase). Assim, interações entre proteínas celulares e a NS5 vêm sendo estudadas com o intuito de se compreender melhor o mecanismo de replicação e patogênese de vários membros da família Flaviviridae, e consequentemente para o desenho racional de drogas. Através de screening em sistema duplo-híbrido em levedura contra biblioteca de cDNA de células Hela, foi demonstrado através da ativação de genes repórteres que o domínio RNApol (Fragmento A) da NS5 interage com a proteína humana eIF3L. Objetivos: Caracterizar a interação entre o domínio RNA polimerase da proteína N5S do vírus da febre amarela e a proteína celular eIF3L, com mapeamento da interação, confirmação e localização da interação NS5-eIF3L em culturas celulares e in vitro; avaliar a influencia de eIF3L na replicação viral; caracterizar biofisicamente a proteína eIF3L. Materiais e métodos: 1) Mapeamento. A proteína eIF3L será testada para interação com RNApol e Frag A(RNApol) em levedura. Será gerado um modelo estrutural do domínio RNApol para análise da localização do Frag A. Para delimitar o domínio mínimo de interação entre RNApol e eIF3L, o Frag A será subdividido em três segmentos os quais serão amplificados e clonados em pGBKT7 para transformação sequencial com pACT2- eIF3L em ensaios de duplo-híbrido. Para avaliação dos resíduos críticos de NS5 para a interação com eIF3L, será induzida mutações sítios dirigida em NS5 analisadas em duplo-híbrido; 2) Interação em culturas celulares. Para confirmar que a interação NS5-eIF3L forma um complexo in vivo, o teste de co-imunoprecipitação das proteínas NS5 e eIF3L será realizado usando células Hela transfectadas com plasmídeos eIF3L-FLAG e NS5-HA e analisados por western blotting. Para localizar a interação NS5-eIF3S6IP na célula, será realizado o teste de imunofluorescência, usando plasmídeos eIF3L-FLAG e NS5-HA transfectados em células Hela; 3) Interação in vitro (GST-pulldown). A eIF3L foi clonada num vetor contendo etiqueta GST e NS5 radiomarcada clonada num vetor contendo etiqueta HA. A proteína quimérica GST-eIF3L será imobilizada em coluna seguida da adição de NS5 radiomarcada e a interação será analisada por western blotting; 4) Para avaliar o efeito de eIF3L na produção do vírus da Febre Amarela e influência na síntese de fitas positivas e negativas do vírus, serão geradas células estáveis da linhagem LLC-MK2 (células renais de macaco rhesus) eIF3L Knock-down (eIF3L KD) e over-expressando eIF3L (eIF3L OE), para posterior infecção com 0,1MOI de YFV e análise por PCR em tempo real; 5) Expressão, purificação e renaturação in vitro da proteína eIF3L. Será realizada a expressão em escala quantitativa para futuros ensaios de caracterização espectroscópicas. A proteína recombinante será, purificada por técnicas cromatográficas inicialmente por afinidade como, por exemplo, a resina níquel para proteínas His-tagged. Caso a proteína esteja presente como corpo de inclusão após a expressão, será feita uma solubilização com um tampão contendo uréia ou cloreto de guanidina e, então, submetida a métodos de purificação por cromatografia líquida. Em seguida, a amostra purificada será submetida às tentativas de reenovelamento usando um conjunto de soluções contendo uma variedade de aditivos através do método da diluição. A concentração da proteína será determinada através da medida de absorbância da mesma a 280 nm. Uma vez obtidas quantidades suficientes, as amostras serão submetidas à caracterização biofísica por dicroismo circular e infravermelho. (AU)