Caracterizacao molecular e funcional de miosina v em compartimentos nucleares e centrossomos

Resumo

Miosina-Va (MVa) é um motor molecular ativo que gera força e movimento sobre os filamentos de actina e está envolvida no transporte intracelular de organelas e RNA. Miosinas de várias classes surpreendentemente são presentes no núcleo onde estão envolvidas em funções ainda não bem esclarecidas. O anticorpo monoclonal 9E6 (mAb9E6) foi gerado contra um fosfo-peptídeo correspondente ao domínio da cauda globular da MVa que contém a serina 1650 e através deste anticorpo a MVa foi localizada nos núcleos celulares interfásicos associadas à speckles nucleares e em mitose nos centrossomos. Além disso, frente à inibição da transcrição por actinomicina D a MVa localiza-se nos nucléolos. Nosso objetivo neste trabalho é determinar os parceiros moleculares da MV nos speckles nucleares, nucléolos e nos centrossomos. Células HeLa e HEK293T serão transfectadas com proteínas recombinantes correspondentes aos domínios da MVa e MVc conjugadas ao GFP e analisadas por microscopia confocal. Também, serão aplicadas técnicas bioquímicas, como isolamento de speckles nucleares, nucléolos e centrossomos, imunomarcação em western blots, imunoprecipitação e pull down. Polipeptídios desconhecidos serão identificados por espectrometria de massa. Os dados preliminares do laboratório e da literatura dão suporte para a execução deste projeto, além da infra-estrutura presente no departamento. Esperamos, dessa forma, definir as moléculas que interagem com a MVa em seu estado fosforilado nestes compartimentos. (AU)