Miosina-Va promove a desmontagem das adesões focais e a migração celular

Resumo

As miosinas constituem a diversa super-família de motores moleculares dependentes de actina, que realizam uma ampla variedade de funções fundamentais, incluindo a citocinese, migração celular, contração celular e transporte intracelular e correto posicionamento de vesículas, organelas e moléculas. Recentemente, demonstrou-se que a miosina Va (MVa) está envolvida na migração celular e encontra-se mais expressa em células tumorais metastáticas. As etapas de invasão e metástase são responsáveis pelo fenótipo maligno das células tumorais, contribuindo para mais de 90% das mortes por câncer. Portanto, desvendar os mecanismos moleculares envolvidos nessas etapas pode levar ao desenvolvimento de estratégias para tratamento do câncer ou prevenção da progressão da doença. O processo de adesão é essencial para a motilidade celular, proliferação, sobrevivência e diferenciação celular. É mediado por integrinas e a tirosina-quinase de adesão focal (FAK), que executa diversos eventos de fosforilação que são críticos para a adesão, migração e sobrevivência. Estudos prévios em nosso laboratório mostraram que MVa interage diretamente com FAK funciona acima de FAK para mediar a sua ativação e endereçamento para as extremidades das protrusões, em sítios de adesão focal nascentes, na proção anterior das células em migração. Os objetivos do presente projeto são: (i) mapear sítios de ligação específicos nas estruturas das proteínasMVa e FAK, através de ensaios de pull down ou imunoprecipitação; ii) obter imagens da dinâmica in vivo de MVa e FAK marcadas com etiquetas fluorescentes durante a formação e dissociação das adesões focais, através de microscopia confocal time-lapse; iii) investigar o envolvimento da MVa no processo de expressão de integrinas na superfície de fibroblastos e células de melanoma, usando anticorpos específicos para marcação de integrinas para análise por microscopia confocal e citometria de fluxo; iv) investigar o envolvimento da miosina-Va na expressão global de moléculas de superfície, utilizando abordagem proteômica, na qual as proteínas de membrana serão marcadas por biotina e enriquecidas em coluna de estreptavidina. O perfil proteômico das proteínas expressas na superfície destas células será avaliado por LC-MS/MS. Para os ensaios serão utilizados fibroblastos nulos para MVa derivados de pacientes com Síndrome de Griscelli e as mesmas células resgatadas pela re-expressão de MVa, além de células de melanoma humano knockdown para MVa por expressão de shRNA mediada por lentivírus. Todas as linhagens celulares e ferramentas de DNA recombinante já estão disponíveis em nosso laboratório. Estas estratégias objetivam avaliar os mecanismos por trás da interação entre MVa e FAK e projetarão nova luz em alguns dos eventos chave da dinâmica de adesão focal, que é o controle central da adesão e migração celular.