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Efeito não-genômico do tratamento com t3 e e2 na expressão gênica de amphiregulin em células tumorais de mama

Processo: 09/15607-2
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Doutorado
Vigência (Início): 01 de março de 2010
Vigência (Término): 28 de fevereiro de 2014
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Bioquímica - Biologia Molecular
Pesquisador responsável:Celia Regina Nogueira
Beneficiário:Maria Teresa de Sibio
Instituição-sede: Faculdade de Medicina (FMB). Universidade Estadual Paulista (UNESP). Campus de Botucatu. Botucatu , SP, Brasil
Assunto(s):Neoplasias mamárias   Fisiopatologia

Resumo

Introdução: Sabe-se que o E2 e o status hormonal da paciente é importante para a proliferação e o tratamento do câncer de mama (CaM) . Quanto ao T3, apesar dos estudos epidemiológicos serem ainda contraditórios em relação a sua influência no câncer de mama, estudos laboratoriais demonstram sua capacidade de aumentar a proliferação de células de CaM com ER positivo, induzindo a expressão de genes normalmente estimulados por E2 (PR, TGF a ).Os hormônios, em geral, necessitam dos seus receptores para mediar suas ações. Os receptores hormonais nucleares (RN) são proteínas regulatórias que interagem com o DNA em regiões específicas, modulando a transcrição gênica nas células-alvo.As ações genômicas clássicas do T3 são mediadas pelos receptores de hormônio tireoidiano. Embora o T3 exerça muitas ações pela regulação genômica clássica da transcrição gênica, um número de efeitos do T3 ocorre rapidamente e não são afetados por inibidores da transcrição e da síntese protéica.Ações não genômicas dos hormônios tireoidianos são descritas na membrana plasmática, no citoplasma e em organelas celulares. In vitro, independente da síntese protéica, T4 induz IP3 e sinalização pelo cálcio aumentando os efeitos de interferon-g via PKC e PKA.Em trabalho recente,do nosso grupo, foi demonstrado que o gene da Amphiregulin (AR) foi estimulado por E2 e T3 nas células MCF-7.O AR é um fator de crescimento regulador multifuncional. Dependendo de sua concentração, células alvo e presença de outros fatores de crescimento, AR é capaz de inibir ou estimular a proliferação celular Martinez-Lacaci et al. (1995) realizaram experimentos tratando células MCF-7 com E2 10-9M, E2 10-9M associado ao TAM 10-6M (E2+TAM), TAM sozinho e controle (apenas com etanol) durante 24 horas. Observaram que a adição de TAM ao tratamento com E2 fez com que houvesse uma diminuição de 38% da expressão do RNAm da AR. Assim, sugerem que o mecanismo de ação do E2 estimulando a expressão de AR seja via ER. Por outro lado nós demonstramos, através da técnica de microarrays que a adição de TAM ao E2 no tratamento da MCF-7 diminuiu em 15% a expressão ocasionada pelo E2 sozinho. Como essa diminuição foi pouco importante, esse resultado sugere que o mecanismo de ação seja não-genômico.Hipótese: O estrógeno e o hormônio tireoidiano alteram a expressão do gene AR sem a necessidade de ligação com receptores nucleares, ou seja, em um curto período de tempo (via não-genômica).Objetivo: Determinar a via de ação dos hormônios tireoidianos e estrogênico na ativação gênica da anphiregulin em linhagens celulares de adenocarcinoma de mama.Metodologia: A linhagem celular de câncer de mama MCF-7 e MDA-MB 231serão plaqueadas em garrafas para cultura de 150cm3, até a confluência de 40%. As culturas serão mantidas à 37o C em uma atmosfera umidificada com 95% O2 e 5% CO2 durante os intervalos de tempo de 10 minutos, 30 minutos, 1 hora e 4 horas com E2 (10-7M), T3 (10-8M), E2 (10-7M) + ICI (1µM), T3 (10-8M) + ICI (1µM), ICI (1µM). Optamos pelo ICI 182.780 nesse trabalho porque esse anti-estrogênio é puro e não tem ação própria como o TAM. Todos os tratamentos empregados serão realizados em triplicata. Em seguida serão conservadas em nitrogênio liquido até que se realize a extração de RNA total. Haverá a troca, no início do tratamento, do SFB inativado pelo tratamento com carvão dextrana, além da troca do RPMI pelo RPMI sem fenol vermelho. Em um segundo grupo, as células MCF-7 e MDA-MB-231 passarão pelos mesmos tratamentos na presença de Actinomicina D (5.0 pg/ml), inibidor da síntese de mRNA, para verificar se a expressão de AR é dependente da expressão gênica celular. No terceiro grupo essas mesmas células serão submetidas ao tratamento com cicloexamida (50mM), inibidor da expressão protéica, para verificar se a expressão de AR é dependente dessa expressão.Será realizado extração de RNA total e para a obtenção do cDNA - Transcrição reversa (RT) do RNA e PCR tempo real.

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Publicações acadêmicas
(Referências obtidas automaticamente das Instituições de Ensino e Pesquisa do Estado de São Paulo)
SIBIO, Maria Teresa de. Ação do hormônio triodotironina (T3) altera a expressão gênica do oncogene Amphiregulin (Areg) el células tumorais de adenocarcinoma de mama. 2014. 47 f. Tese de Doutorado - Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho" Faculdade de Medicina..

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