Estudo da sinalização por GMP cíclico em Blastocladiella emersonii: clonagem, expressão e caracterização de uma fosfodiesterase de cGMP

Resumo

Várias funções celulares são reguladas pelos nucleotídeos cíclicos cAMP e cGMP. Embora trabalhos anteriores tenham mostrado variações nos níveis de cGMP durante o ciclo de vida do quitridiomiceto B. emersonii e haja evidências da existência de enzimas específicas envolvidas na síntese e degradação desse nucleotídeo cíclico neste fungo, genes codificando enzimas guanilato ciclases e fosfodiesterases de cGMP não foram descritos em fungos até o momento. Uma investigação recente no banco de ESTs de B. emersonii (http://blasto.iq.usp.br), revelou a existência de uma EST codificando uma fosfodiesterase putativa. Análises de alinhamento da seqüência desta fosfodiesterase revelou uma maior similaridade com a fosfodiesterase de cGMP da família 9A de eucariotos superiores, assim como a presença de três resíduos de aminoácidos que são conservados somente entre PDEs da família 9A. Poucos trabalhos têm mostrado a existência de guanilato ciclases, fosfodiesterases de cGMP e proteínas que ligam cGMP em fungos e plantas. Evolucionistas atribuem isso ao estilo de vida sedentário e a completa perda de motilidade de todas as células destes organismos. No entanto, os quitridiomicetos divergiram cedo na linhagem dos fungos e estes organismos apresentam células móveis em pelo menos um estágio do ciclo de vida, o que poderia explicar a existência dessa via nesses fungos primitivos. Assim, esse trabalho busca confirmar a existência e caracterizar a fosfodiesterase (BePDE) através de clonagem do gene em bactéria, produção de proteínas recombinantes com e sem mutações em seu sítio catalítico e testes de atividade in vitro.