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Mutações Sítio-dirigidas nas Regiões do Sítio-Ativo e da Interface Oligomérica do Fator Inibitório da Migração dos Macrófagos de Leishmania major (LmjMIF2)

Processo: 09/04272-0
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Mestrado
Vigência (Início): 01 de setembro de 2009
Vigência (Término): 30 de abril de 2010
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Bioquímica - Química de Macromoléculas
Pesquisador responsável:Arthur Henrique Cavalcante de Oliveira
Beneficiário:Elise Marques Freire Cunha
Instituição-sede: Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto (FFCLRP). Universidade de São Paulo (USP). Ribeirão Preto , SP, Brasil
Assunto(s):Enzimas   Bioquímica de proteínas   Estrutura e função de proteínas   Mutagênese sítio-dirigida

Resumo

O fator inibitório da migração dos macrófagos (MIF), originalmente descrito como uma citocina de células T humanas, inibe a migração de macrófagos. MIF é considerado um importante fator no controle de infecção por parasitas. Ratos resistentes deficientes de MIF-/- tornaram-se mais suscetíveis à infecção por L. major e Trypanosoma cruzi. A descrição na literatura da presença de MIF homólogas na secreção de parasitas sugere uma modulação da resposta imunológica pelo parasita, via receptor do macrófago (CD74) que a MIF do hospedeiro interage durante a resposta. Recentemente, foi mostrado que um dos dois MIFs de L. major (LmjMIF1) atua inibindo apoptose, indicando que o LmjMIF contribui para sobrevivência do macrófago infectado. Assim, o objetivo do presente projeto é a investigação estrutural e funcional do fator inibitório da migração dos macrófagos (MIF) de L. major com a produção de mutantes na região do sítio ativo e da interface oligomérica para avaliar a importância dessas regiões na atividade biológica do LmjMIF.A seleção das posições a serem mutadas na estrutura do MIF foi baseada no objetivo de se estudar o papel da atividade enzimática e do estado de oligomerização na atividade biológica de interação com macrófagos. Os mutantes propostos nesse projeto, K33A e G67A, foram descritos como importantes para a atividade de tautomerização por estabilizarem o substrato no sítio ativo do MIF de mamíferos. A avaliação cinética desses permitirá a comparação dos efeitos das mutações com os MIFs de mamíferos. Todas estruturas descritas de MIFs são triméricas em cristal, mas a maioria foi observada como dímeros em solução, incluindo a LmjMIF2 recombinante do nosso laboratório em filtração em gel (Aux. Regular 07/06755-2). Assim, a mutação sítio-dirigida de triptofanos e resíduos de regiões de interface oligomérica, aliada com estudos espectroscópicos em solução podem contribuir para uma resposta de qual a estrutura quaternária da MIF2 de L. major está em solução e se essa estrutura é aquela que interage com o receptor dos macrófago. Mutações na região de interface oligomérica, alça C-terminal (N109P e del103-113), possibilitarão avaliar o papel desses resíduos na oligomerização (alteração ou impedimento do processo) e se essa oligomerização é necessária para a atividade biológica. Esses mutantes serão analisados por filtração em gel para indicar o estado de oligomerização resultante das mutações realizadas.Os mutantes de triptofanos (W66L, W108F) serão usados principalmente estudos de emissão fluorescência intrínseca do triptofano (IFTE) e de dicroísmo circular para avaliação das estruturas secundárias, terciária e quaternária das proteínas mutantes. Com fluorescência, serão avaliadas a supressão e anisotropia de florescência intrínseca, que informam sobre o acesso de supressores e do movimento da cadeia lateral dos triptofanos, permitindo inferências sobre estrutura terciária e da oligomerização dos MIF mutantes. Estudos de desnaturação térmica, por agentes desnaturantes e por variação de pH serão feitos com dicroísmo circular e possibilitarão mapear as alterações na estrutura secundária e terciária desses mutantes, indicando o perfil de mudanças no estruturais das regiões dos triptofanos (sítio ativo e C-terminal) durante a oligomerização da MIF2 de L. major. Estudos de dicroísmo circular e da fluorescência intrínseca do triptofano serão realizados para a avaliação da estabilidade da estrutura secundária, terciária e quaternária dos MIFs mutantes.A avaliação da atividade catalítica e da oligomerização do fator LmjMIF2 serão correlacionadas com a atividade de inibição de migração de macrófagos que já foi feita em nosso laboratório com a MIF2 recombinante selvagem, que apresentou atividade inibitória. Assim, o efeito das mutações será avaliado com interação com macrófagos em cultura e indicará o papel da atividade tautomerásica e do estado de oligomerização na atividade de inibição de migração dos macrófagos.

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Publicações acadêmicas
(Referências obtidas automaticamente das Instituições de Ensino e Pesquisa do Estado de São Paulo)
CUNHA, Elise Marques Freire. Mutações sítio-dirigidas nas regiões do sítio-ativo e da interface oligomérica do fator inibitório da migração dos macrófagos de Leishmania major (LmMIF2). 2011. Dissertação de Mestrado - Universidade de São Paulo (USP). Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto (PCARP/BC) Ribeirão Preto.

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