Mecanismos de Indução de Lesões em DNA por Luz UVA e seus Efeitos Biológicos

Resumo

A proposta do presente trabalho consiste na irradiação de amostras de DNA plasmidial com luz UVA na presença de diferentes substâncias para estudar os possíveis mecanismos envolvidos na indução de lesões de DNA por estes comprimentos de onda, como por exemplo: catalase para eliminar o H2O2 da solução; EDTA / Chelex 100 para eliminar metais eventualmente ligados à molécula de DNA como ferro e cobre; envolvimento de oxigênio singlete com irradiação realizada e água deuterada (D2O), e adição de inibidores, como azida na solução; nucleotídeos à amostra de DNA, para verificar uma possível absorção de UVA pelas bases nitrogenadas e consequente formação de estado excitado, resultando em espécies reativas dentro da própria molécula de DNA; irradiação em água e tampões salinos para verificar se a alteração causada na conformação da molécula de DNA leva a maior ou menor absorção de luz UV pelas bases.A determinação e quantificação dos diferentes tipos de lesões de DNA formadas após as irradiações serão realizadas com a utilização de enzimas de reparo de DNA (glicosilase e endonucleases) que reconhecem e clivam o sítio contendo lesões específicas. Complementando estas análises, serão realizados ensaios com anticorpos específicos para as lesões CPD e 6-4 PP. Além disso, pretendemos analisar os efeitos biológicos dessas lesões na transcrição de genes repórteres em células humanas, tanto proficientes como deficientes em reparo de DNA. Esses ensaios deverão ser realizados através da determinação de atividade da proteína luciferase, codificada pelo gene repórter. Portanto, com a realização destas análises bioquímicas e biológicas, pretende-se desvendar como as lesões induzidas pela luz UVA na molécula de DNA são geradas, analisando os mecanismos indiretos (fotossensibilizadores) e os diretos (absorção dos comprimentos de onda pela molécula de DNA).A determinação e quantificação dos diferentes tipos de lesões de DNA formadas após as irradiações serão realizadas com a utilização de enzimas de reparo de DNA (glicosilase e endonucleases) que reconhecem e clivam o sítio contendo lesões específicas. Complementando estas análises, serão realizados ensaios com anticorpos específicos para as lesões CPD e 6-4PP. Além disso, pretendemos analisar os efeitos biológicos dessas lesões em células de mamíferos, tanto em proficientes quanto em deficientes em reparo de DNA, por meio da utilização de luciferase. Portanto, com a realização destas análises bioquímicas e biológicas, pretende-se desvendar como as lesões induzidas pela luz UVA na molécula de DNA são geradas, analisando os mecanismos indiretos (fotossensibilizadores) e os diretos (absorção dos comprimentos de onda pela molécula de DNA).