Identificação de diferentes modos de ligação do domínio N-terminal da Angiotensina II com receptores AT1 selvagem e mutantes

Resumo

Verificou-se em estudo anterior que células CHO transfectadas com o receptor AT1 induziu taquifilaxia à [Lys2]-AII, efeito este atribuído à falta de regiões 3, 5-não traduzidas (3, 5-UTR) no cDNA para o receptor AT1. Além disso enquanto a taquifilaxia à AII era específica em linhagem de células de músculo liso arterial de coelho, que expressa o receptor AT1 endogeno, após co-transfecção com o gene para o receptor AT1 sem 3 ,5-UTR, as células se tornaram taquifiláticas para a [Lys2]-AII. Assim investigaremos se o receptor recombinante seria superexpresso ou se a taquifilaxia seria devida à predominância do receptor AT1 exógeno. Em outra abordagem sobre o receptor AT1, em recente estudo observou-se uma predominância na expressão do mutante do receptor AT1, C18S, na região perinuclear que na membrana plasmática das células CHO transfectadas com esse mutante. A hipótese de uma possível internalização constitutiva do mutante será investigada utilizando antagonistas específicos do receptor AT1. A tentativa de reversão será avaliada através de testes de ligação do receptor com o ligante na membrana, além da determinação de níveis de IP3 e de [Ca+2]i em células tratadas com os antagonistas do receptor AT1. Será testada a tecnologia de fluorescência polarizada em um leitor especifico de microplacas para medir a formação de IP3 e para a dosagem de [Ca+2]i com o fluo-3 como marcador do Ca2+, através de microscopia confocal. Em todos os testes serão utilizados além da AII outros análogos deste peptidio com substituição na região N-terminal ([Sar1]-AII, [Lys2]-AII e [Sar1Lys2]-AII). Outra hipótese que o receptor não foi convenientemente transportado para a membrana plasmática será investigada através de teste de colocalização com a calnexina, uma chaperona envolvida com a correta maturação de proteínas e transferência para a membrana. A detecção dessa calnexina será feita via fluorescência do anticorpo conjugado secundário anticoelho marcado com o fluoróforo Texas Red, utilizando-se microscópio confocal sem o tratamento e após tratamento com antagonista específico para a reversão da possível internalização.