Clonagem, expressao e estudo de especificidade das calicreinas humanas hk5 e hk7.

Resumo

As calicreinas humanas hK5 e hK7 fazem parte de uma família de 15 serino peptidases (hK1-hK15) que, a exceção de hK1, hK2 e hK3, foram recentemente identificadas e caracterizadas como calicreinas. Pouco se conhece sobre a especificidade destas enzimas, mas alguns dados experimentais sugerem que hK5 e hK7 podem estar participando ativamente de processos fisiopatológicos relacionados à descamação da pele. Portanto, a caracterização de suas especificidades é crucial, não apenas para mapear os sítios de interação enzima/substrato, bem como para o desenvolvimento de substratos e inibidores específicos e seletivos para ambas as enzimas. Pretendemos clonar e expressar hK5 e hK7 usando dois vetores de expressão, pET-28a(+) e pPIC9K. O primeiro vetor será usado para produzir as enzimas em células de E. Coli, visando à produção de anticorpos monoclonais. As enzimas usadas no estudo de especificidade serão produzidas com o vetor pPIC9K em células de P. pastoris. A caracterização da especificidade das hK5 e hK7 será feita com p uso de peptídeos com supressão intramolecular de fluorescência, baseados na seqüência de referência Abz-KLRSSKQ-EDDnp, que tem se mostrado eficiente no estudo de outras peptidades. Com os dados cinéticos obtidos a partir do estudo de especificidade estaremos empenhados no desenvolvimento de substratos fluorescentes seletivos e específicos para as hK5 e hK7 e. além disso, usando bibliotecas de inibidores de serino peptidases pretendemos buscar inibidores seletivos e específicos para esta enzimas. (AU)