Estudo de rnas regulatorios em leishmania.

Resumo

O genoma de Leishmania major foi seqüenciado e sua anotação deve incluir a grande maioria das proteínas. No entanto pequenos RNAs funcionais como produto final, que não pertençam às categorias bem caracterizadas, como rRNAs, tRNAs, snoRNAs, etc., não foram anotados. A descrição, em outros organismos, de pequenos RNAs não codificadores (ncRNAs) como elementos envolvidos na regulação da expressão gênica e o fato de que o controle da expressão gênica nos tripanosomatídeos é primordialmente pós-transcricional foram os fatores que nos levaram ao presente trabalho. Em estudo anterior, investigamos três potenciais ncRNAs de Leishmania, ODD1, ODD2 e ODD3; geramos recombinantes desses genes que foram transfectados em Leishmania para sua superexpressão. Os transfectantes foram investigados quanto a mudanças fenotípicas e modificações dos níveis de potenciais mRNAs alvo. Entre os três ncRNAs, apenas o superexpressor de ODD3 apresentou mudanças fenotípicas, apresentando-se sob forte efeito citostático em cultura axênica, com morfologia alterada e modificações de sua ploidia. A investigação de mRNAs alvo para ODD3, por RT-PCR e bioinformática, encontrou um potencial alvo localizado na região à montante de uma ORF do cromossomo 18 de L. major, anotada como provável cadeia leve de dineína. Outro possível transcrito alvo do gene ODD3 é o gene que codifica para uma proteína hipotética conservada, do cromossomo 21 de L. major, com domínio de uma Leucil/Fenilalanil-tRNA-transferase. Resultados preliminares indicam haver diminuição desse transcrito no parasita que superexpressa ODD3. Nesse trabalho buscaremos evidências de que as interações descritas para esses ncRNAs como possíveis riborreguladores acontecem. Essas investigações serão iniciadas pela busca de pequenos transcritos de ODD3 e seus alvos, evidenciando uma possível degradação desses mRNAS por mecanismos ainda não conhecidos. Uma análise da importância das estruturas primária e secundária do mRNA de ODD3, deve ser feita por mutagênese sítio digirida, mudando a seqüência primária de tal forma que os grampos conservados da estrutura secundária sejam mantidos ou desmontados. A taxa de síntese do transcrito de ODD3 deverá ser comparada entre as linhagens superexpressora e controle, buscando responder se a superexpressão de ODD3 exige uma degradação rápida do transcrito. A superexpressão de ODD3 pode interferir com o nível de proteínas de possíveis alvos, essa investigação deve ser feita por análise do perfil de proteínas diferencialmente expressas entre o mutante e controles. Se não demonstrarmos interações do ncRNA ODD3 com potenciais mRNAs alvo, a interação com produtos protéicos deve ser investigada in vitro por ensaios de retardo em gel e western blot e/ou imunoprecipitação. Essas abordagens permitirão entender o modo de ação e interações desse ncRNA, elucidando um novo caminho para o controle da expressão gênica, ainda inédito, nesse parasita.