Regulação intermolecular da proteína DICER pelo aldeído 4-hidroxinonenal: uma abordagem translacional

Resumo

O estresse oxidativo está associado ao estabelecimento e progressão de diversas patologias. Além da sua ação direta sobre os constituintes celulares, as espécies reativas de oxigênio (EROs) são responsáveis pela geração de outras moléculas pró-oxidantes, como é o caso do aldeído 4-hidroxi-2-nonenal (4-HNE), produto da peroxidação lipídica. Esse aldeído apresenta alta reatividade com biomoléculas, sendo capaz de formar ligações de alta afinidade (adutos) com proteínas, lipídios e DNA, as quais estão associadas à modificação da função e degradação de seus alvos, de modo que seu acúmulo tem sido correlacionado ao desenvolvimento de inúmeras doenças como o câncer, doenças neurodegenerativas e cardiovasculares. Experimentos preliminares do nosso laboratório utilizando ratos com disfunção ventricular esquerda identificaram um aumento significativo nos níveis de 4-HNE cardíaco, associado ao desenvolvimento da patologia. Adicionalmente, realizamos uma proteômica com o intuito de verificar quais proteínas cardíacas formavam adutos com o 4-HNE na disfunção ventricular esquerda. Dentre os resultados obtidos, foi identificada a formação de adutos de Michael entre 4-HNE e três resíduos da proteína DICER (K1324, H1325 e H1339). A DICER é uma endonuclease essencial na biogênese dos miRNAs, e consequentemente, na regulação gênica pós-transcricional. Trabalhos recentes demonstraram que a exposição ao estresse oxidativo reduz a expressão da DICER. Entretanto, os mecanismos envolvidos nesse processo, bem como sua contribuição na biogênese de miRNA, regulação gênica pós-transcricional e funcionamento celular ainda não foram elucidados. Nesse contexto, o objetivo do presente projeto de pesquisa é caracterizar o 4-HNE como agente regulador da DICER em condições de estresse oxidativo. Para isso, validaremos nossos achados iniciais de interação entre 4-HNE e DICER e seu impacto no perfil de miRNAs em modelo de disfunção ventricular esquerda. Além disso, caracterizaremos as consequências dessa interação na atividade e perfil de expressão da DICER em cultura celular (células HEK 293 e H9C2), em lisado tecidual, e in vivo utilizando o nematoide Caenorhabditis elegans que expressa constitutivamente o constructo DICER-EGFP. O efeito direto dessa interação será estudado in vitro utilizando DICER recombinante selvagem e com mutações pontuais que neutralizam a ação do 4-HNE nos respectivos aminoácidos. Ainda, testaremos o potencial farmacológico da ativação seletiva da enzima aldeído desidrogenase 2 (ALDH2) na prevenção ou redução da interação 4-HNE-DICER in vivo e m cultura celular. A ALDH2 é a principal enzima envolvida na degradação do 4-HNE. Por fim, esses achados serão validados em biópsias cardíacas de doadores e pacientes portadores de insuficiência cardíaca etiologia isquêmica, fortalecendo o caráter translacional da presente proposta de pesquisa. Nossa hipótese é que o acúmulo de 4-HNE no estresse oxidativo prejudica diretamente a atividade e/ou perfil de expressão da DICER através do aduto 4-HNE-DICER, afetando a biogênese de miRNAs. Nossos resultados preliminares são promissores, demonstrando que o tratamento com 4-HNE compromete a biogênese de siRNA em células HEK ao longo do tempo. Considerando a atual relevância do perfil de miRNAs na biologia e fisiopatologia celular, uma compreensão mais detalhada de possíveis interações intermoleculares que afetem a atividade de enzimas limitantes no processo de biogênese dos miRNAs, bem como sua regulação pelo estresse oxidativo será de grande valia para o futuro emprego de terapias farmacológicas e não farmacológicas que atuem em mecanismos-chave envolvidos na fisiopatologia de doenças degenerativas, como a insuficiência cardíaca. Ressalto que esse projeto é um desfecho do auxílio à pesquisa, modalidade Jovem Pesquisador, finalizado recentemente (#2012/05765-2). (AU)