Produção transiente in vitro e in vivo de Fator IX de coagulação sanguínea humana (hFIX) para a caracterização, avaliação da atividade e screening funcional da via mamária com vistas à produção de hFIX no leite do bovinos transgênicos

Resumo

Este projeto de visa integrar ferramentas biotecnológicas avançadas para estabelecer um sistema eficiente de produção do fator de coagulação sanguíneo IX recombinante humano (rhFIX) para o tratamento da Hemofilia B, doença causada pela deficiência desta proteína funcional na cascata de coagulação sanguínea. A síntese do hFIX é hepática e na forma inativa de serino-protease, onde sofre diversas modificações pós-traducionais (MPT) antes da secreção ao plasma. O FIX ativado (FIXa) ativa o Fator X da coagulação, há a formação de trombina a partir da pró-trombina e a formação de fibrina do fibrinogênio, que, ao se polimerizar, consolida o tampão plaquetário ou coágulo. A mutação no hFIX leva à falha na coagulação e à Hemofilia B. O tratamento da Hemofilia B tem como base a reposição do hFIX pela infusão intravenosa do concentrado de hFIX. No Brasil, o tratamento é realizado totalmente com FIX derivado do plasma humano, processado no exterior que volta liofilizado com altos custos ao SUS (R$ 52 milhões/ano), além da chance de veicular doenças. Estes sistemas de produção de rhFIX podem ser substituídos por métodos mais produtivos, como a plataforma animal de produção de proteínas na glândula mamária, principal objetivo em longo prazo desta proposta. O leite de animais transgênicos é considerado uma das melhores fontes de obtenção de proteínas recombinantes para uso biomédico, sendo altamente competitiva, com baixo custo de implementação e elevada produtividade. A execução deste projeto visa o uso da capacidade secretória do leite para a produção eficaz de proteínas complexas como o rhFIX, que é centrado na capacidade da glândula mamária de realizar modificações co- e pós-traducionais de forma comprovadamente mais eficiente do que em células em cultivo. Em termos gerais, visamos a produção do Fator IX humano recombinante (rhFIX) na sua forma ativa em grande escala e de forma eficaz no leite de bovinos por meio de dois excelentes sistemas biológicos para o screening e produção do rhFIX em larga escala na plataforma animal, buscando ultimamente alternativas que garantam a produção de proteínas funcionais no modelo transgênico animal. Em virtude da eficiência e rapidez em se obter proteínas recombinantes, um dos sistemas para a obtenção e screening do rhFIX, é a expressão transiente da proteína de interesse (rhFIX) utilizando-se vetores adenovirais recombinantes (rAAV). Propõe-se a expressão transiente de proteínas recombinantes in vitro, em células da glândula mamária em cultivo, e in vivo, na glândula mamária de fêmeas caprinas e leporinas lactantes, por metodologia já bem estabelecida por nossos colaboradores no Brasil. Serão produzidas as partículas de adenovírus recombinantes in vitro, que serão injetadas na glândula mamária de fêmeas bovinas e leporinas. Dessa forma, o rFIX e a rFurina serão produzidos de maneira transiente no leite, permitindo testar a construção bicistrônica e caracterizar o rhFIX produzido nos distintos sistemas. Uma vez purificadas do meio de cultivo ou do leite, o rhFIX recombinantes será avaliado quanto à estrutura e atividade, para então estabelecer linhagens transgênicas de células somáticas de bovinos, para no futuro (Fase II) serem utilizadas para o desenvolvimento de bovinos transgênicos pela clonagem animal. A construção gênica bicistrônica dos genes de hFIX e hFurina será inserida em vetor que contém promotor que direciona a expressão exclusiva para a glândula mamária. Para o estabelecimento eficiente deste modelo de animal transgênico, outras tecnologias suporte serão utilizadas em combinação aos dois sistemas de expressão, como o uso de safe harbour loci, e o sistema de edição do DNA por CRISPR/Cas9. Desta forma, o transgene será utilizado na co-transfecção de fibroblastos fetais bovinos com sistema CRISPR/Cas9 para o locus ROSA26 do genoma bovino, com posterior seleção e diagnóstico molecular das células transgênicas, com vistas à utilização futura na clonagem por TNCS. (AU)