Avaliação da expressão de miRNAs reguladores do ZEB1, envolvido na transição epitélio-mesênquima em câncer de cabeça e pescoço

Resumo

O carcinoma de células epidermóides de cabeça e pescoço (CCECP) é o sexto tipo de câncer mais comum no mundo. O diagnóstico tardio, associado ao aparecimento de tumores secundários resultam em uma sobrevida de apenas 35% em cinco anos, apesar dos avanços terapêuticos. Esses dados mostram que é necessário desenvolver novas estratégias para melhorar o diagnóstico precoce, o prognóstico e estabelecer terapias efetivas. Uma das possibilidades é a identificação de biomarcadores, como as células-tronco tumorais (CTT), que possuem potencial de autorrenovação e diferenciação. Inúmeras evidências têm comprovado que as CTT atuam na iniciação e progressão do tumor, nas metástases, na resistência a rádio e quimioterapia. Outro biomarcador que está sendo muito estudado é o micro-RNA (miRNA), pequenos RNAs não codificantes que regulam pós-transcricionalmente a expressão de genes alvos, levando a inibição ou superexpressão das proteínas. Os miRNAs regulam a proliferação celular, diferenciação, migração, apoptose, sobrevida, morfogênese e carcinogênese. Expressão alterada de miRNAs pode levar a inibição de genes supressores de tumor ou superexpressão de oncogenes e ao desenvolvimento do câncer. Estudos recentes têm demonstrado que os miRNAs também regulam as CTT, no entanto, pouco se sabe sobre o perfil de expressão e o papel dos miRNAs sobre essas células. Objetivos: O projeto tem como objetivo geral identificar possíveis biomarcadores para CCECP, que poderão ser utilizados como novos alvos terapêuticos, por meio da avaliação da expressão de miRNAS reguladores do ZEB1, envolvidos no processo de EMT, em CTT e em células tumorais não tronco, isoladas de CCECP. Os objetivos específicos do presente projeto são: 1) Avaliar a expressão dos miRNAs miR-101, miR-139, miR-153, mir-200 e mir-205, reguladores do ZEB1, envolvido na regulação do processo de EMT, em CTT CD44+/ALDH1+ e em células tumorais não tronco ALDH1-/CD44-, obtidas de culturas primárias de CCECP; 2) Comparar os níveis de expressão dos miRNAs entre as duas populações de células, visando identificar diferenças que possam estar relacionadas com a agressividade tumoral; 3) Realizar a análise funcional, in vitro, dos dois miRNAs que apresentarem maior diferença na expressão, em CTT CD44+/ALDH1+, para confirmação de seu papel regulador do ZEB1. Metodologia: As CTT e células tumorais não-tronco serão obtidas de cinco amostras frescas de CCECP primários, submetidas a cultivo celular. As células serão separadas por Citometria de fluxo (FACSAria II - Becton Dickinson), utilizando o marcador de superfície celular CD44 e, por meio da atividade da ALDH1, que será detectada pelo kit do ensaio Aldefluor (Stem Cell Technologies). As CTT, marcadas positivamente para ALDH1+/CD44+ e, as células tumorais não-tronco, marcadas negativamente (ALDH1-/CD44-), serão submetidas a avaliação do potencial tumorogênico, por meio da capacidade de formação de colônias de esferas tumorais e de invasão e migração, em Matrigel. Após estas etapas as células serão multiplicadas e submetidas a extração do RNA total, para análise do perfil de expressão do gene ZEB1 e dos cinco miRNAs preditos, por qRT-PCR. Dois miRNAS serão selecionados para análise funcional, empregando-se a técnica de transfecção de miRNA, seguido da análise da expressão dos miRNAs por qRT-PCR. Também será avaliada a expressão gênica e proteica do gene ZEB1, por qRT-PCR e Western Blot, respectivamente. Todos os resultados serão avaliados por análise estatística apropriada. Resultados esperados: Espera-se que o presente estudo possa contribuir para identificação de biomarcadores para o CCECP, por meio da expressão de miRNAs em CTT, que poderão ser utilizados no diagnóstico, prognóstico e também como novos alvos terapêuticos para novos medicamentos. (AU)