Compreensão das bases moleculares e estruturais de proteínas envolvidas na sinalização do c-di-GMP e do sistema de secreção tipo II em Leptospira interrogans serovar copenhageni

Resumo

O alvo de estudo deste projeto são proteínas do patógeno humano L. interrogans. Esta bactéria é o agente causador da leptospirose, uma doença infecciosa re-emergente considerada uma zoonose mundial que acomete vários animais incluindo humanos. Mais de 500 mil casos de leptospirose severa são relatados por ano, e em casos severos o paciente acaba chegando a óbito. Pouco se sabe sobre a biologia de L. Interrogans e esta bactéria contém vários genes envolvidos no ciclo de vida do mais importante segundo mensageiro bacteriano c-di-GMP, sugerindo um papel importante desta molécula na biologia desta espiroqueta. c-di-GMP está envolvido na regulação do estilo de vida da maioria das espécies bacterianas, que podem viver em unidades independentes ou como membros agregados de uma colônia. Esta decisão de vida comunitária versos solitária está muitas vezes correlacionada a outros processos fisiológicos importantes, como, por exemplo, motilidade, adesão a superfícies, produção de fatores de virulência, secreção de exopolissacarídeos. Portanto, não seria uma surpresa se descobrirmos que c-di-GMP está envolvida na regulação da biologia de L. interrogans, como na formação do flagelo e da própria maquinária de biossíntese do sistema de secreção tipo II (T2SS), assim como na expressão de diferentes fatores de virulência. Portanto, o estudo do funcionamento das redes proteícas envolvendo c-di-GMP em seu centro regulatório é essencial para a compreensão da biologia de espécias de Leptospira, assim como para o entendimento das vias de patogenicidade de L. interrogans Compenhage. O T2SS tem um papel central na secreção de proteínas enoveladas do citoplasma para o meio extracelular. Por ser o único sistema de secreção em Leptospira interrogans, é provável que ele esteja envolvido nos processos de sobrevivência da bactéria em diferentes habitats, e também, no processo de invasão e colonização da bactéria em mamíferos. Desta forma, o estudo das proteínas que compõe o cluster de genes do T2SS, irá fornecer informações chaves para a elucidação do mecanismo de funcionamento do T2SS em Leptospira interrogans e terá um impacto grande na compreensão da biologia desta bactéria.Esta proposta é uma continuação do projeto regular de número FAPESP 2013/18664-2, que termina no final do mês de Julho deste ano. Em dois anos de projeto determinamos a estrutura tridimensional do domínio GAF de LIC13137 em complexo com o nucleotídeo cíclico cAMP, mostramos que LIC13137 produz c-di-GMP apenas em complexo com cAMP e determinamos as constantes cinéticas da produção de c-di-GMP. Este trabalho foi submetido a revista JBC e estamos aguardando os comentários dos revisores. Ensaios funcionais preliminares mostraram que LIC13137 é transcrita e traduzida em resposta a antibiótico. Além disso, fechamos colaboração com o grupo do Dr. Ray Owens, chefe da Facility de Produção de Proteínas de Oxford (Oxford Protein Production Facility_OPPF-UK) no Reino Unido. Nesta colaboração a maioria dos genes de interesse assim como fragmentos que codificam alguns domínios foram clonados em vetores de expressão pOPINF e triagens para busca de bons candidatos para estudo estrutural foram feitos. Com base nos resultados obtidos no projeto anterior, temos como objetivos para os próximos dois anos: 1- Estudo estrutural de PilZ (XAC10128, já temos cristais), 2- estudo estrutural e funcional dos genes codificados pelo cluster LIC11125-LIC1131PAS-GGDEF (já temos cristais dos domínios PAS de LIC11127 e LIC11128) e determinação funcional de LIC13137. Dentro do subprojecto do sistema de secreção tipo II, temos como objetivo específico: 1- Estudo funcional e estrutural de LIC11567 (possível antitoxina) e LIC11568 (possível toxina); 2- Estudo estrutural de GspG, a pseudopilina majoritário do sistema. Nossos estudos serão feitos usando diferentes técnicas de biologia estrutural e várias técnicas de bioquímica de macromoléculas. (AU)