Hiperglicemia e migração de fibroblastos em matrizes extracelulares 3-D, composição e remodelação da matriz - potencial regulação por microRNAs 31, 196a e 29b

Resumo

A cicatrização deficiente é uma das complicações mais comuns da hiperglicemia (HG) e está associada à microangiopatia, neuropatia e alterações funcionais de fibroblastos. Alguns estudos utilizando fibroblastos obtidos de pacientes diabéticos, ou fibroblastos cultivados em condições que simulam a HG, demonstraram alterações na proliferação celular e síntese de proteínas da MEC. Poucos estudos, no entanto, abordaram os efeitos da HG sobre a migração destas células, sobre as propriedades físicas da MEC e sobre a sua renovação. Estudos prévios deste grupo mostraram que fibroblastos derivados da derme de ratos diabéticos ou expostos in vitro a uma elevada concentração de glicose migram menos sobre substratos bidimensionais (2-D) constituídos por fibronectina ou colágeno I. Nestas condições as células apresentam velocidade e direcionalidade reduzidas, maior número de protrusões celulares simultâneas e não produtivas (retráteis) e menor amadurecimento das adesões celulares junto à MEC. Estes efeitos foram revertidos na presença do antioxidante N-acetilcisteína (NAC). Não estão esclarecidos, no entanto, os efeitos da HG sobre a migração de fibroblastos em ambientes tridimensionais (3-D), assim como seus efeitos sobre a síntese de MEC. Recentemente, microRNAs (miRs) foram demonstrados como importantes moduladores da migração celular (miR-31, p.ex.) e da síntese de MEC (miR-196a e miR-29b, p.ex.). Nós demonstramos previamente que a expressão de miR-31 aumentou cerca de 3 vezes em fibroblastos obtidos de animais diabéticos, quando comparados com fibroblastos de animais controle. Em fibroblastos NIH-3T3, a HG aumentou a expressão de miR-31 em 50% após 3 dias de exposição. Nestas células, o tratamento com o antioxidante NAC preveniu o aumento do miR-31, mantendo-o em níveis normais, e evitando o aumento no número de protrusões não efetivas. A expressão de miR-31 exógeno em NIH-3T3 aumentou o número de protrusões celulares improdutivas e simultâneas e reduziu a direcionalidade das células, sem afetar a velocidade celular. Uma hipótese deste projeto é que a glicose elevada regula a expressão de miR-31 através da geração de espécies reativas de oxigênio. Este miR, por sua vez, regula negativamente a expressão de proteínas importantes para o processo de migração celular. Outros miRs potencialmente relevantes que regulam a MEC, como miR-196a e miR-29b, alterados durante a fase final de remodelação da MEC na cicatrização cutânea de diabéticos, também podem ser menos expressos em fibroblastos, alterando a proporção colágeno III/colágeno I e fibronectina. Assim, este estudo tem por objetivos principais: 1) em fibroblastos NIH-3T3, avaliar a expressão de alvos do miR-31 (miR-31-5p), preditos por Bioinformática, que possam ser responsáveis pelo fenótipo observado nestas células mantidas sob glicose elevada: RhoA, Radixina, Rock1, Rock2, integrinas ±v e ±5. Validar estes alvos por meio de ensaios de luciferase e, em células expostas à glicose elevada, inibir a expressão de miR-31-5p com antagomiR e avaliar uma possível reversão (provavelmente parcial) do fenótipo migratório e 2) utilizando fibroblastos derivados da pele humana, avaliar os efeitos da glicose elevada sobre a migração celular em ambientes tridimensionais (3-D) e sobre a produção e remodelação da MEC. Será feita uma análise da expressão de moléculas de matriz extracelular e de adesão por RT PCR Array (84 genes). Serão utilizadas culturas 3-D em MEC derivada de células (MDC) e géis de colágeno I/fibronectina. Na MDC, alterações da composição bioquímica e da organização promovidas pela glicose também serão avaliadas. Proteoglicanos e glicosaminoglicanos (inclusive ácido hialurônico) serão analisados. A potencial regulação da MEC por microRNAs miR-196a e miR-29b será avaliada nas culturas, tanto em células quanto no meio extracelular (microvesículas secretadas). (AU)