Desenvolvimento de linhagens de Saccharomyces cerevisiae através da expressão heteróloga de celulases e engenharia evolutiva visando a sacarificação e fermentação simultânea da biomassa lignocelulósica

Resumo

A fim de reduzir a dependência das fontes de energia fósseis e aumentar a segurança energética, vários países estão à procura de alternativas sustentáveis, como o bioetanol. Uma abordagem promissora para aumentar a produção de bioetanol é o uso da biomassa lignocelulósica, tais como o bagaço e palha de cana de açúcar, resíduos industriais gerados no processo de produção do etanol de primeira geração. Duas estratégias podem ser empregadas para produção de bioetanol - SHF (hidrólise e fermentação separadas) e SSF (sacarificação e fermentação simultânea) - e embora o primeiro processo seja o mais utilizado, o segundo (SSF) é mais otimizado e menos oneroso, resultando na hidrólise da lignocelulose e fermentação dos açúcares redutores dentro do mesmo compartimento. No entanto, a S. cerevisiae não consegue metabolizar carboidratos complexos em etanol, como por exemplo, a celulose, componente majoritário do bagaço e da palha de cana de açúcar. Neste sentido, a expressão de celulases originárias de outros micro-organismos em S. cerevisiae pode ser uma alternativa, possibilitando a sacarificação e fermentação simultânea da biomassa lignocelulolítica em bioetanol. Também é importante salientar que as linhagens de leveduras industriais são submetidas a condições de fermentação (temperatura e pH) diferentes das condições ótimas de hidrólise das enzimas (celulases) exigindo adaptação da população, como por exemplo, elevação da temperatura durante o processo SSF. Em face disto, este projeto objetiva empregar o processo de SSF para a produção de bioetanol, inserindo celulases de Acremonium strictum (isolado do bioma Brasileiro) em linhagens industriais de S. cerevisiae (PE-2 e SA-1) e subsequente realização de engenharia evolutiva para selecionar linhagens mais adaptadas às condições de hidrólise. Perante isto, espera-se obter linhagens de S. cerevisiae que possam expressar celulases a fim de melhorar a hidrólise da biomassa lignocelulósica e, assim, aumentar a disponibilidade da glicose. Após evolução das linhagens modificadas, esperamos alcançar maior secreção e atividade das enzimas e, consequentemente, maiores níveis de etanol no meio em comparação com as linhagens inalteradas. Para expressão heteróloga das celulases de Acremonim strictum em S. cerevisiae utilizaremos a metodologia de CRISPR/Cas9, que permite a integração dos genes de interesse no genoma da levedura, com muita precisão, além de eficiência e flexibilidade. Para a evolução das linhagens será empregado o uso do agente mutagênico EMS para estimular a ocorrência de mutações aleatórias e em seguida ocorrerá pressão seletiva em meios de cultivo desfavoráveis como forma de selecionar linhagens capazes de resistir ás condições de stress. Após evolução e confirmação da expressão das enzimas, serão realizadas fermentações empregando diferentes substratos, dentre eles bagaço e palha de cana pré-tratados. As fermentações serão realizadas em shakers em anaerobiose em condições pré-determinadas através da engenharia evolutiva. Os produtos gerados durante as fermentações serão quantificados por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). Dentre as fermentações realizadas, a que apresentar melhor fator de conversão de substrato em produto (YS/P), será conduzida em fermentador de bancada, a fim de simular as condições das usinas e de tal modo produzir bioetanol de 2ª geração a partir da sacarificação e fermentação simultânea da biomassa lignocelulósica. (AU)