Caracterização do Fator Inibitório da Migração dos Macrófagos de Leishmania major (LmjMIF2): Contribuição da Interface Oligomérica para a Estrutura e Função

Resumo

O fator inibitório da migração dos macrófagos (MIF), originalmente descrito como uma citocina de células T humanas inibe a migração de macrófagos. MIF é considerado um importante fator no controle de infecção por parasitas. Camundongos resistentes à infecção por L. major e Trypanosoma cruzi tornaram-se susceptíveis, após a deleção do gene do MIF. A descrição na literatura da presença de MIF homólogas na secreção de parasitas sugere uma possível modulação da resposta imunológica pelo parasita, pelo mesmo receptor do macrófago (CD74) do MIF do hospedeiro. Recentemente, foi mostrado que um dos dois MIFs de L. major (LmjMIF1) atua inibindo apoptose, indicando que o LmjMIF contribui para sobrevivência do macrófago infectado. Assim, o objetivo do presente projeto é investigar o papel das interações intersubunidades na manutenção da estrutura e função do MIF de L. major (LmjMIF2), por meio da caracterização biofísica e bioquímica de mutantes de triptofano único e com alterações na cauda C-terminal. Sequências mutantes da LmjMIF2 contendo triptofano único e mutações na cauda C-terminal serão produzidos por reações de PCR, clonadas e usadas para expressão em E. coli e purificação as proteínas mutantes. Estudos de desnaturação com dicroísmo circular e fluorescência usando variação térmica e agentes desnaturantes possibilitarão o mapeamento do perfil de mudanças estruturais das regiões dos triptofanos (do núcleo proteico e da cauda C-terminal da molécula). O acompanhamento dessas alterações conformacionais na estrutura terciária desses mutantes, indicará a importância dessas regiões para a manutenção do enovelamento da LmjMIF2 de L. major. O estado oligomérico dos mutantes será avaliado por filtração em gel, por espalhamento de baixo ângulo (SAXS) e por eletroforese de gel nativo. Assim, a mutação sítio-dirigida de triptofanos, mantendo um triptofano próximo às regiões de interface oligomérica, aliada com estudos espectroscópicos em solução, podem contribuir para indicar a estrutura quaternária da MIF2 de L. major em solução e, se essa estrutura é aquela que interage com o receptor dos macrófagos. A avaliação na atividade funcional de inibição de migração de macrófagos será feito com interação com macrófagos imortalizados J774 e indicará o papel do estado de oligomerização na atividade da LmjMIF2. Ainda, após a obtenção de parasitas superexpressando as MIFs mutantes, será avaliada o papel das regiões mutadas na virulência, por lesão de patas de camundongo, e na infectividade, pela invasão de macrófagos.O estudo da estrutura em solução de mutantes, especialmente da cauda C-terminal, contribuirá para caracterizar a manutenção da estrutura quaternária em solução relacionando-a com a atividade de interação com o receptor do macrófago. Esses estudos viabilizam a identificação de regiões da MIF homóloga de Leishmania, diferentes da MIF humana, que podem ser essenciais para a atividade, durante o ciclo de vida do parasita. Essas regiões podem ser, futuramente, sítios de ligação de novas drogas de combate ao desenvolvimento do parasita. (AU)