Desenvolvimento de vacinas recombinantes contra Streptococcus pneumoniae

Resumo

Streptococcus pneumoniae é um importante patógeno humano, causando pneumonia, otite média e meningite, atingindo principalmente crianças, idosos e indivíduos imunodeficientes. Devido à indução de proteção estritamente sorotipo específica, a produção de uma vacina anti-pneumocócica requer uma enorme estrutura, e a vacina contra pneumococco atualmente no mercado consiste de uma mistura de polissacarídeos (PS) de 23 cepas. Ademais, vacinas polissacarídicas induzem uma resposta imune timo-independente não efetiva em crianças. O uso de antígenos proteicos em sistemas de apresentação alternativos poderia ampliar a cobertura vacinar, com possível ativação do mecanismo celular de resposta imunológica. Diversas proteínas de pneumococo, como pneumolisina e PspA tem sido investigadas. A proteína de superfície, PsaA, demonstrou ser imunogênica e protetora em animais experimentais e parece ser consideravelmente conservada nas 23 cepas vacinais. Propomos investigar o potencial da PsaA em 4 diferentes sistemas de apresentação vacinar: 1) vacina conjugada PS-Psa recombinante; 2) BCG recombinante expressando PsaA; 3) lactobacilo recombinante expressando PsaA; e 4) vacina de DNA-PsaA. O desenvolvimento de uma vacina conjurada PS-PsaA poderia resultar em um antígeno eficiente, de amplo espectro e timo-dependente. Eficiente porque para bactérias encapsuladas, os PS são os melhores antígenos. O amplo espectro e a timo-dependência seriam garantidos pela ligação covalente com a PsaA recombinante. O desenvolvimento da vacina conjugada PS-PsaA irá passar pelas seguintes etapas: 1) expressão da PsaA em E. coli e sua purificação; 2) fermentação de uma cepa prevalente de pneumococo e purificação de seu PS; e 3)conjugação da PsaA com PS e sua purificação. Vacinas de BCG recombinante tem sido consideradas forte candidatas a sistema vivo de apresentação de antígenos, especialmente para países em desenvolvimento, onde o sistema de saúde dificilmente alcança toda a população. A vacina de BCG recombinante-PsaA vai requerer alto nível de expressão da PsaA através de um promotor micobacteriano forte, o pBlaF* (um promotor mutado da M. fortuitum). Outros promotores serão investigados. A constituição de sistemas de expressão que possam ser utilizados em humanos será investigado por 2 abordagens: 1) constituição de um auxotrofo leuD- através de troca alélica, usando um gene de leuD mutado em um vetor suicida contendo o gene do SacB como marcador de contra-seleção para selecionar eventos de dupla troca. O auxotrofo leuD- pode então ser transfectado com um vetor de expressão com o antígeno heterólogo e o gene do leuD; 2) constituição de um BCG negativo para beta-lactamase usando o SacB como marcador de contra-seleção, para investigar seu potencial como locus para integração de um cassete de expressão por recombinação homologa. GFP (green fluorescent protein)seria usado como um marcador de seleção. O desenvolvimento de um lactobacilo recombinante expressando PsaA irá requerer primeiramente a constituição de um vetor de expressão adequado. O gene da PsaA seria então clonado neste vetor e o lactobacilo recombinante analisado quanto à expressão do antígeno heterólogo. A indução de uma resposta imune e de proteção contra Spneumoniae pela imunização oral com o lactobacilo-PsaA recombinante será avaliada. Uma estratégia que tem sido vista com entusiasmo no desenvolvimento de novas vacinas é a costituição de vacinas de DNA, que induzem a produção dos antígenos dentro das células. A vacina de DNA-PsaA será construída no vetor de expressão em mamíferos, pcDNA3 e diferentes vias de inoculação serão avaliadas. Um segundo antígeno, a porção conservada da PspA pode ser incluído e a dupla expressão será testada. A variabilidade imunológica da PsaA de cepas isoladas no Brasil será investigada por Dot Blot e Western Blot e o gene das cepas mais prevalentes serão sequenciados. A indução de unia resposta imune contra PsaA será caracterizada em camundongos para todas as preparações vacinais desenvolvidas. A reatividade cruzada e proteção contra desafio por cepas heterólogas também será determinada. Possíveis respostas celulares serão investigadas pela análise do perfil de citocinas no soro e nos respectivos sobrenadantes de esplenócitos de camundongos vacinados. Este projeto pretende explorar diversas possibilidades de se usar a PsaA recombinante como antígeno em diferentes sistemas de apresentação, que podem levar ao desenvolvimento de uma vacina eficaz e de ampla cobertura contra pneumococo, enquanto consolidamos nossa competência no desenvolvimento e teste de vacinas recombinantes e conjugadas. (AU)