Marcadores da expressão gênica e proteica da neoformação óssea sob influência de laser de baixa intensidade.

Resumo

O tecido ósseo possui função mecânica, de depósito mineral e hematopoiética sendo composto por três tipos celulares, osteoblastos, osteócitos e osteoclastos. Diversas substâncias são secretadas pelos osteoblastos como proteínas e o cálcio, que tem papel fundamental na homeostase celular e na produção do tecido ósseo mineralizado e em cujo fluxo estão envolvidos os genes S100A6, PMCA1b e a osteocalcina ligados ao processo transporte e de mineralização. Diversos recursos podem ser utilizados para alterar a permeabilidade celular e antecipar o processo de mineralização como o laser de baixa intensidade. O laser caracteriza-se por uma luz monocromática de comprimento de onda específico que possui capacidade de modulação celular pelo aumento da respiração celular, síntese de DNA e tradução proteica. O objetivo deste trabalho será avaliar os efeitos do laser de baixa intensidade no que se refere a sinalização de cálcio e mineralização óssea, na expressão dos genes e proteínas S100A6, PMCA1b e osteocalcina em células osteoblásticas adultas. Células da linhagem celular de osteoblastos humanos hFOB 1.19 (ATCC® CRL-11372") serão distribuídos em dois grupos A (n=12, sem laser) e B (n=12, laser). As células serão re-suspendidas e cultivadas em meios Ham's F12 e Eagle (1:1), adicionado de L-glutamina, soro fetal bovino (10%), gentamicina (10 mg/mL) e fungizone (250 ¼g/mL). A partir do 1º dia, o grupo B será irradiado com laser de baixa intensidade de Arseneto de Gálio e Alumínio »=808nm, 250mW de potência nominal, densidade de potência de 200mW/cm2, densidade de energia de 2000mJ/cm2, dose de energia de 2J/cm2, diâmetro de feixe de 0,02mm, tempo de 5s em 1 ponto de aplicação até o 13º dia. As células serão cultivadas por 13 dias com coletas diárias de células para realização das técnicas de PCR em tempo real, Western Blotting para a osteocalcina, PMCA1b e S100A6 e adicionalmente para o Patch clamp. O RNA será extraído, quantificado, submetido a síntese de cDNA e realizada quantificação pela técnica de 2-””Ct comparativo. As extrações proteicas serão realizadas pelos kits M-PER e N-PER, as proteínas submetidas a corrida em eletroforese de SDS-PAGE e posterior transferência para membranas de nitrocelulose para incubação com os anticorpos primários e secundários e revelação para posterior análise. Adicionalmente a técnica de patch clamp será realizada para avaliação dos canais iônicos, especificamente os canais de cálcio. Espera-se que após a irradiação do laser ocorra um aumento na expressão gênica de S100A6, PMCA1b e osteocalcina, na expressão proteica de S100A6, PMCA1b e osteocalcina e do fluxo de cálcio intracelular. (AU)