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Incorporação sítio específica de aminoácidos não naturais em proteínas: desenvolvimento de novas tecnologias de incorporação e aplicação no estudo de proteínas

Resumo

Nesses últimos 4 anos temos trabalhado nas técnicas de incorporação sítio-específica de resíduos de aminoácidos não naturais em proteínas. Para isso duas metodologias estão sendo desenvolvidas paralelamente: -a primeira é a introdução de análogos de triptofano (5-Fluor-Trp, 5-hidroxi-Trp, 7-aza-Trp, 5-bromo-Trp e 5-nitro-Trp) no lugar dos resíduos de Trp, em cepas de E. coli compatíveis com os vetores que utilizam a T7 polimerase (expressão através do forte promotor T7). Os mais conhecidos e utilizados são os vetores comerciais pET (Novagen - Merck Millipore); -a segunda é a introdução de resíduos de aminoácidos não naturais utilizando-se um par ortogonal tRNA - tRNA-sintetase modificados, para a incorporação do aminoácido p-nitro-fenilalanina (sonda aceptora de fluorescência) no lugar de um dos códons de parada (UAG - amber códon), introduzido na posição desejada no gene da proteína de interesse por mutação sítio-dirigida. A princípio a aplicação dessas tecnologias será no estudo da relação estrutura-atividade da peptidase timet oligopeptidase tentando-se relacionar as alterações conformacionais que esta peptidase pode sofrer devido à interação de um ligante em seu centro de catálise. Tais objetivos são descritos em maiores detalhes no projeto. Porém, a escolha dessa peptidase como o primeiro alvo desse estudo se deu devido às características dos aminoácidos não naturais escolhidos (sondas espectroscópicas), mas principalmente devido a nossa experiência no estudo dessa peptidase, inclusive através de mutantes. Entretanto, como temos tido sucesso na incorporação tanto dos análogos de triptofano como do resíduo de p-nitro-fenilalanina, outras proteínas alvo e outras aplicações estão sendo preparadas. Exemplos: outras peptidases que podem sofrer grandes alterações conformacionais durante a catálise; inibidores protéicos de serino peptidases (serpinas) e anticorpos recombinantes que poderão servir em análises diagnósticas ou mesmo para marcação/localização in vivo; e proteínas de membrana. E também a obtenção das construções necessárias para incorporação de outros resíduos de aminoácidos não naturais também está em desenvolvimento. Exemplos: aminoácido coumarínico (sonda fluorescente), p-azido-fenilalanina e p-benzoil-fenilalanina (grupos foto-reativos) que podem ser utilizados para marcação específica ou para estudos de interações proteína-proteína. (AU)

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Publicações científicas (5)
(Referências obtidas automaticamente do Web of Science e do SciELO, por meio da informação sobre o financiamento pela FAPESP e o número do processo correspondente, incluída na publicação pelos autores)
BELIZARIO, JOSE E.; SIRCILI, MARCELO P. Novel biotechnological approaches for monitoring and immunization against resistant to antibiotics Escherichia coli and other pathogenic bacteria. BMC Veterinary Research, v. 16, n. 1 NOV 2 2020. Citações Web of Science: 0.
BELIZARIO, JOSE E. Cancer Risks Linked to the Bad Luck Hypothesis and Epigenomic Mutational Signatures. EPIGENOMES, v. 2, n. 3 SEP 2018. Citações Web of Science: 0.
OLIVEIRA-SOUZA, WELLINGTON P.; BRONZE, FELLIPE; BROOS, JAAP; MARCONDES, MARCELO F. M.; OLIVEIRA, VITOR. On the efficient bio-incorporation of 5-hydroxy-tryptophan in recombinant proteins expressed in Escherichia coli with T7 RNA polymerase-based vectors. Biochemical and Biophysical Research Communications, v. 492, n. 3, p. 343-348, OCT 21 2017. Citações Web of Science: 1.
ICIMOTO, MARCELO Y.; FERREIRA, JULIANA C.; YOKOMIZO, CESAR H.; BIM, LARISSA V.; MAREM, ALYNE; GILIO, JOYCE M.; OLIVEIRA, VITOR; NANTES, ISELI L. Redox modulation of thimet oligopeptidase activity by hydrogen peroxide. FEBS OPEN BIO, v. 7, n. 7, p. 1037-1050, JUL 2017. Citações Web of Science: 2.
GILIO, JOYCE M.; MARCONDES, MARCELO F.; FERRARI, DEBORA; JULIANO, MARIA A.; JULIANO, LUIZ; OLIVEIRA, VITOR; MACHADO, MAURICIO F. M. Processing of metacaspase 2 from Trypanosoma brucei (TbMCA2) broadens its substrate specificity. BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA-PROTEINS AND PROTEOMICS, v. 1865, n. 4, p. 388-394, APR 2017. Citações Web of Science: 6.

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