Implantação da histologia Clarity e microscopia de fluorescência planar para o estudo do sistema nervoso

Resumo

Técnicas histológicas e de microscopia promoveram a visualização de estruturas celulares e foram responsáveis por enormes avanços na compreensão de funções complexas nos organismos. No entanto, a complexa organização tridimensional de neurônios e células gliais no tecido nervoso é perdida no fatiamento histológico para a observação ao microscópio, prejudicando o estudo de sua morfologia pela pequena área passível de análise quantitativa. CLARITY é uma nova técnica histológica que permite o estudo de estruturas proteicas celulares in situ. A técnica CLARITY se assemelha a um Western Blot, no qual ao invés de as proteínas presentes serem extraídas e identificadas em um gel de poliacrilamida, as mesmas são mantidas em sua organização espacial de origem e um hidrogel é produzido no tecido que se deseja estudar. A grande dificuldade encontrada na visualização do tecido nervoso íntegro diz respeito à grande quantidade de lipídeos presentes principalmente na bainha de mielina em torno dos axônios. A técnica CLARITY permite a retirada por eletroforese dos lipídeos sem comprometer a estrutura proteica do tecido nervoso permitindo a análise quantitativa de grandes porções do tecido. Após a eletroforese a matriz de hidrogel híbrida contendo a estrutura proteica do tecido fica transparente à luz. As proteínas podem ser visualizadas ao microscópio por técnicas de imunohistoquímica com marcadores fluorescentes. Como uma nova tecnologia ainda em desenvolvimento a histologia CLARITY é discutida amplamente em fóruns na Internet como o www.forum.claritytechniques.org. Microscópios adaptados para a visualização de tecido nervoso processado pela histologia CLARITY estão sendo desenvolvidos baseados em fluorescência por light-sheet ou iluminação planar. Normas abertas para a construção desses microscópios foram estabelecidas e estão disponíveis na internet. A especificação escolhida para esse projeto é a OpenSPIM (Open Access Selective Plane Illumination Microscopy) do consórcio formado pelo Instituto Max Planck e o Conselho Europeu de Pesquisa (www.openspim.org).A combinação dessas duas novas tecnologias permitirá grandes avanços no estudo quantitativo de grandes áreas do tecido nervoso de animais experimentais com sua estrutura tridimensional preservada. A implantação dessas tecnologias com o uso de plataformas abertas permitirá o desenvolvimento de pessoal capacitado para a instalação e manutenção da rotina histológica e os sistemas de microscopia com baixo custo. (AU)