Sequenciamento de DNA de segunda geração (NGS) aplicado ao diagnóstico em microbiologia clínica

Resumo

Os seres humanos são suscetíveis a infecções causadas por uma grande diversidade de agentes patogênicos microbianos, sendo as doenças infecciosas a principal causa de mortalidade humana em todo o mundo. Assim, um diagnóstico preciso do agente causador de infecção é um dos passos cruciais para a definição de um tratamento clínico racional e adequado para tais doenças. Este projeto tem como objetivo verificar a viabilidade da aplicação da tecnologia de sequenciamento de DNA de segunda geração (Next-Generation Sequencing - NGS) na identificação e caracterização de agentes infecciosos a partir de amostras clínicas. A abordagem utilizada neste projeto será o sequenciamento de genomas completos (Whole-Genome Sequencing - WGS) dos agentes infecciosos e também o sequenciamento de regiões gênicas utilizadas na tipagem de microrganismos e de genes de resistência a antimicrobianos. Para verificar a viabilidade dessas abordagens, iremos realizar os testes utilizando amostras clínicas de urina provenientes de pacientes suspeitos de infecção no trato urinário. As amostras utilizadas neste projeto serão cedidas pelo Laboratório de Análises Clínicas (UNILAB) da cooperativa de trabalho médico UNIMED do Município de São Carlos. Deveremos utilizar nos testes o DNA extraído do precipitado de urina centrifugada, bem como As colônias isoladas obtidas pela inoculação das amostras de urina em meio de cultura (procedimento de rotina realizado no UNILAB-São Carlos). A extração do DNA bacteriano das amostras de urina e das colônias isoladas será realizada inicialmente utilizando o kit QIAamp® DNA Mini kit (QIAGEN) e a biblioteca de DNA adequada para o sequenciamento, preparada utilizando kit Nextera® XT Sample Preparation (lllumina), porém protocolos independentes de kits comerciais serão testados a fim de minimizar os custos destes procedimentos. Os sequenciamentos NGS serão realizados em um equipamento MiSeq® System (Illumina) disponível no Laboratório Multiusuários Centralizado - ESALQ-USP - Piracicaba, coordenado pelo Prof. Dr. Luiz Lehmann Coutinho. Os dados de sequenciamento dos genomas completos e sequenciamentos parciais de regiões gênicas de interesse serão analisados e submetidos à predição quanto à tipagem e genes de resistência utilizando os bancos de dados disponíveis no Center for Genomic Epidemiology e PubMLST. Para avaliar o uso de sequenciamento NGS diretamente de amostras clínicas, iremos comparar os resultados obtidos por sequenciamento, tanto das amostras quanto das colônias isoladas, com aqueles obtidos pelos métodos convencionais em microbiologia clínica. Assim, este projeto visa contribuir para o estabelecimento do diagnóstico clínico pela tecnologia NGS para a obtenção de um diagnóstico rápido e independente de cultura celular, trazendo grandes benefícios ao sistema de saúde e aos pacientes. (AU)