Metabolismo de carboidratos durante o amadurecimento de frutos: aplicações da genômica funcional

Resumo

O amadurecimento de frutos é um processo complexo, altamente coordenado em diversos níveis metabólicos correlacionados ao seu desenvolvimento na planta. O conhecimento dessas transformações e dos seus mecanismos moleculares de controle são importantes para estabelecer bases científicas para o desenvolvimento de novas tecnologias de conservação pós-colheita e manutenção ou melhoria da sua qualidade nutricional e organoléptica. Entre as transformações mais importantes incluem-se as sofridas pelos carboidratos que tem um papel crítico na vida útil da fruta e no desenvolvimento de qualidades como textura e adoçamento. O conjunto de resultados obtidos em projeto temático anterior sobre os carboidratos, desenvolvido em nosso laboratório, permitiu avançar na compreensão das transformações do amido e seu controle durante o amadurecimento de frutos como a banana, o mamão, manga e outros não-climatéricos. Isto foi conseguido investigando a degradação do amido associada à síntese de sacarose em frutos inteiros ou em modelos, a sua correlação com diversas enzimas do metabolismo de carboidratos, e o seu controle via expressão gênica e alguns hormônios. Em bananas, o amido sofre um processo de corrosão axial (como mostrado por microscopia eletrônica) que deve-se à ação de diversas enzimas. Com relação às enzimas envolvidas, a alfa-amilase compõe uma família de genes pouco expressos no fruto, mas tem produção constante, suficiente para uma ação inicial facilitadora sobre o amido, sendo a sua síntese pouco influenciada por auxinas e giberelinas. Já a B-amilase, parece ter uma só cópia e tem aumento significativo de expressão e de atividade enzimática, portanto submetida a uma regulação gênica sensível ao ácido indol-acético e menos por giberelinas, como conseguimos demonstrar em modelos com fatias isoladas. Em conjunto com a alfa-amilase atua a fosforilase com produção de G-1-P, que parece a mais eficiente via para a síntese da sacarose. Contudo, a fosforilase parece ser ativada não por expressão gênica mas por translocação de metabólitos para o amiloplasto. Ainda, além das alfa e B-amilases e fosforilases, existe participação das alfa-glicosidases cuja atividade é significativamente aumentada e enzimas desramificadoras. A infiltração de hormônios vegetais, como o AIA e giberelina, trouxe informações interessantes a respeito do desencadeamento do processo de degradação do amido. De acordo com os resultados dos experimentos com AIA, a transformação do amido e a síntese da sacarose não estão totalmente associadas ao climatério, uma vez que é possível reduzir o teor de amido e a formação de sacarose sem alterar a respiração e a produção de etileno. Os resultados obtidos no tema referente à textura e parede celular avançaram o conhecimento disponível sobre o assunto em sementes e frutas, no sentido da composição química e organização da parece celular e lamela média e do mecanismo das mudanças pós-colheita envolvidos. Esses resultados permitiram estabelecer novas hipóteses a respeito do controle do metabolismo de carboidratos e das transformações que ocorrem no amiloplasto e na parede celular, e que resultam no adoçamento e amaciamento de frutos como a banana e o mamão. Contudo, as informações geradas trazem novas questões, exigindo não apenas um aprofundamento das pesquisas sobre o metabolismo de carboidratos durante o amadurecimento, mas também, a adoção de novas estratégias de estudo. A aplicação de um vasto instrumental químico, bioquímico e de biologia molecular permitiu, até o momento, que boa parte das enzimas consideradas como as mais relevantes dos processos fossem estudadas, porém, apesar de terem sido conhecidas algumas características moleculares, cinéticas e da expressão dos respectivos genes, as limitações dessa abordagem são evidentes. A continuação e aprofundamento dos estudos já iniciados são absolutamente necessários, porém, em razão da complexidade da regulação do metabolismo de carboidratos e sua relação com outros eventos do amadurecimento, uma abordagem mais ampla e integrada em vários níveis pode resultar num melhor entendimento dos processos e, consequentemente, maior possibilidade de seu controle. A aplicação das ferramentas da genômica funcional, contemplando os vários níveis do fluxo da informação genética, do perfil de mRNAs ao de metabólitos, passando pelas proteínas expressas, permite uma avaliação global do metabolismo e, ao mesmo tempo, integração entre os vários níveis. Assim o objetivo central do projeto é avançar o conhecimento sobre os mecanismos envolvidos no controle do metabolismo de carboidratos de reserva e carboidratos estruturais, em frutos na fase pós-colheita, à partir do estudo integrado da transcrição e expressão gênica, e da organização estrutural e composição química do amiloplasto e da parede celular. Os objetivos específicos se desdobram em estudos envolvendo diferentes modelos, frutos e estratégias envolvendo estudos da composição química, organização molecular e mudanças do amiloplasto (em bananas) e da parede celular (no mamão) por técnicas químicas e instrumentais. Estudos sobre a expressão diferencial de genes principalmente aqueles envolvidos com o metabolismo de carboidratos, na passagem do fruto verde para o maduro e na presença ou não de controladores de amadurecimento como o metil ciclo propeno (MCP). Identificação e caracterização de proteínas e genes que tem sua expressão alterada no amadurecimento ou durante a síntese da parede celular, através de técnicas de proteômica. Expressão heteróloga de enzimas consideradas importantes no processo de transformação do amido e da parede celular. Localização e estudo da expressão in situ de enzimas específicas com anticorpos contra proteínas purificadas ou expressas em sistema heterólogo. Identificação diferencial de metabólitos relacionados ao metabolismo de carboidratos nas diferentes etapas do amadurecimento por técnicas de metabolômica. Os modelos experimentais envolvem frutos inteiros (mamão e banana) ou frutos infiltrados, quando houver necessidade de infiltração de compostos marcados ou precursores específicos. Envolvem ainda o sub-fracionamento celular para a obtenção do amiloplasto, parede celular e aparelho de Golgi que serão estudados isoladamente do tecido inteiro. O planejamento experimental, devido à natureza do projeto, envolve a estreita colaboração dos vários pesquisadores, estando cada grupo encarregado de ver aspectos do problema: nível gênico, proteômica e metabolômica e caracterização química e estrutural. (AU)