Estudo molecular e funcional de transportadores de membrana

Resumo

Os sub-projetos reunidos nessa proposta de Projeto Temático têm em comum o estudo de transportadores iônicos de membrana. Todos os projetos, a exceção de dois que analisam 1) outros aspectos de células glomerulares e 2) o transporte da molécula neutra NH3 através da membrana celular de células envolvidas no transporte e na homeostase de NH3/NH4+, como hepatócidos e células de ductos coletores. Esses projetos também estão focados no transporte iônico em células tubulares renais, com particular interesse nos transportadores de H+, Na+ e K+. Outro elemento comum a esses projetos é o estudo do sistema renina-angiotensina-aldosterona. Em glomérulos, serão avaliadas as interações entre leptina e endotelina e o sistema renina-angiotensina, utilizando linhagens de células mesangiais e podócitos, além de estudos em ratos. Outra abordagem é o estudo do receptor tipo 1 para angiotensina II (AngII), AT1R, e de suas interações com as proteínas ATRAP (AT1R Associated Protein) e HSC70 (Heat Shock Protein 70), visando a análise funcional dessas interações. Serão também avaliadas as consequências funcionais da interação de ATRAP com CAML (Calcium modulating ciclophilin ligand), uma via de ativação dos fatores de transcrição NFAT por AngII, e com RdgB² (Retinal degenerated type B), uma proteína que transloca fosfoinositídeos do retículo endoplasmático para a membrana plasmática. Serão realizados estudos em linhagens celulares de túbulo convoluto distal e ductos coletores para elucidar aspectos moleculares e funcionais da interação de AngII/AT1R com as WNKs (With No Lysine Kinases) 1 e 4, importantes moduladoras do transporte de Na+ e K+ em nefro distal. Será analisada a interação de AngII e angiotensina 1-7 em células de túbulos proximais, e também os efeitos da aldosterona em tecido renal, efeitos não genômicos e efeitos que resultam em lesão renal. Finalmente, serão avaliados os efeitos da AngII e vasopressina sobre o transporte de solutos e água em túbulos proximais de ratos com restrição hídrica, com foco no trocador Na+/H+ - NHE3.Outro aspecto importante dos sub-projetos que compõem esse temático é estudo do efeito das drogas sinvastatina e sildenafil, assim como do peptídeo GLP-1, uma incretina secretada por células intestinais no período pós-prandial, sobre a atividade e expressão de NHE3 em túbulos proximais. Estes, juntamente com estudo dos inibidores da calcineurina, ciclosporina e tracolimus, sobre a atividade e expressão de WNK1 e WNK4 em células de túbulos distais, e o estudo da modulação de canais para K+ sensíveis a voltagem por fenilalquenos, são projetos com interesse clínico e farmacológico mais direto que passam a integrar esse projeto temático. Métodos de investigação propostos incluem medidas de concentração de prótons e potássio em fluido tubular utilizando eletrodos com resinas seletivas, em animais "in vivo", por técnica de micropunção de túbulos renais; medidas de concentração intracelular de prótons e cálcio com a utilização de sondas fluorescentes em túbulos renais isolados e em linhagens de células imortalizadas em cultura, em microscópio de fluorescência e/ou confocal. Técnica de patch clamp para análise de canais iônicos. Análise estrutural por microscopia ótica, imuno-localização de proteínas por microscopia de fluorescência ou imunohistoquímica. Métodos de biologia molecular para expressão e análise de proteínas recombinantes, silenciamento gênico com siRNA, identificação de interações entre proteínas por co-imuno-precipitação e por técnicas de FRET e BRET. Os sub-projetos envolvendo o transporte de amônia visam o entendimento de como NH3 move-se através de canais, e, em nível mais integrado, a importância fisiológica dos canais para gases. A permeabilidade a NH3 será avaliada usando microeletrodos para monitorar alterações no pH da superfície celular causadas pelo influxo de NH3 do extra para o intracelular, em oócitos de rã, após exposição a soluções específicas. (AU)