Investigação da funcionalidade de haplótipos nos genes interleucina 4 e interleucina 8

Resumo

A Doença Periodontal (DP) tem caráter multifatorial, com influência de fatores como a presença de microrganismos periodontopatogênicos, suscetibilidade genética do hospedeiro, reação do sistema imune, hábito de fumar, stress e presença de doenças sistêmicas. O tecido periodontal inflamado produz várias citocinas, dentre elas a interleucina 4 (IL-4) e a interleucina 8 (IL-8). Estudos realizados por este grupo investigaram polimorfismos nos genes IL4 e IL8 em 500 pacientes com e sem periodontite, onde foram identificados indivíduos com suscetibilidade genética à periodontite. Os polimorfismos -251(T/A), +396(T/G) e +781(C/T) no gene IL8, formando o haplótipo ATC/TTC, mostrou 2 vezes maior suscetibilidade à DP (OddsRatioajustado =2,241;95% Intervalo de Confiança = 1,10-4,55). Referente ao gene IL4, indivíduos carregando o haplótipo TCI/CCI formado pelos polimorfismos -590(T/C), +33(T/C) e VNTR(I/D), são 5 vezes mais suscetíveis à DP (OddsRatioajustado= 5,3; 95% Intervalo Confiança = 2,2 -12,9), enquanto o haplótipo TTD/CTI conferiu proteção contra a DP, OddsRatioajustado= 0,18 (95% Intervalo Confiança = 0,04 - 0,88). Recentemente, investigou-se se esses haplótipos influenciariam os níveis de periodontopatógenos, a produção das citocinas IL-4 e IL-8 e a resposta ao tratamento periodontal, comparando os resultados entre pacientes que carregavam os diferentes haplótipos. Os resultados sugeriram que indivíduos classificados como geneticamente suscetíveis à periodontite por carregarem determinados haplótipos no gene IL8 responderiam de maneira mais exacerbada mesmo com baixo desafio microbiano quando comparados aos indivíduos considerados geneticamente resistentes à periodontite. Em relação ao haplótipo no gene IL4 (TCI/CCI), associado à suscetibilidade à DP, foi demonstrado que indivíduos carregando esse haplótipo tiveram maiores níveis de P. gingivalis, T. forsythia, T. denticola quando comparados com pacientes geneticamente protegidos contra a DP (haplótipo TTD/CTI). No entanto, ainda não se sabe como os haplótipos poderiam ter influenciado a expressão gênica e/ou a quantidade de periodontopatógenos. Portanto, é necessário realizar estudos in vitro, com condições mais controladas, para verificar a real funcionalidade dos haplótipos nos genes IL4 e IL8. Assim, são objetivos do presente projeto de pesquisa: 1) A partir de células coletadas do sangue periférico de pacientes com diferentes haplótipos dos genes IL4 e IL8, investigar possíveis diferenças na resposta imune inata e adaptativa; 2) A partir de plasmídeos recombinantes construídos artificialmente contendo os alelos que compõe os diferentes haplótipos (construtos), investigar o papel específico dos polimorfismos na regulação da expressão gênica. Deve-se considerar que, apesar de selecionar os pacientes com os haplótipos de interesse, no objetivo 1, haverá a influência da carga genética total do paciente; enquanto que no objetivo 2, somente a funcionalidade dos referidos polimorfismos/haplótipos nos genes IL4 e IL8 será avaliada. Referente ao objetivo 1: após confirmação por sequenciamento do haplótipo nos genes IL4 e IL8 de cada paciente, será coletado sangue periférico para avaliar a influência de cada polimorfismo/haplótipo na resposta a antígenos pela determinação da expressão gênica de IL-8/IL-4, proteínas secretadas e proteínas intracelulares, e para caracterização do perfil fenotípico celular. Referente ao objetivo 2: constructos contendo os haplótipos (alguns passarão por mutagênese sítio-dirigida), serão transfectados em células NIH3T3 e a funcionalidade dos diferentes polimorfismos/ haplótipos na região promotora e/ou intrônica serão avaliados pela expressão do gene repórter utilizando microscopia de fluorescência e citometria de fluxo. Pretende-se comparar a resposta da possível influência dos diferentes haplótipos entre aquela obtida dos tipos celulares dos pacientes (objetivo1) da resposta obtida por meio da inserção dos constructos na linhagem NIH3T3 (objetivo2). (AU)