Bases celulares e moleculares da aquisição e da extinção da supressão condicionada: prováveis alvos de ação do extrato padronizado de Ginkgo biloba

Resumo

Este projeto tem como objetivo dar continuidade a investigação realizada pelo nosso grupo sobre as bases celulares e moleculares subjacentes a aquisição e a extinção da supressão condicionada. Propõe identificar e caracterizar as modificações morfofuncionais em estruturas neurais relacionadas a estes processos, pouco conhecidas pela comunidade científica. Ainda, fundamentará discussões sobre os efeitos do tratamento com o extrato padronizado de Ginkgo biloba L. (EGb) na memória do medo condicionado, com isso, poderá resultar em nova abordagem farmacológica para o tratamento de déficits cognitivos ou transtornos relacionados à incapacidade de supressão da resposta emocional condicionada, como ocorre na ansiedade. Diversos estudos têm sugerido que a neurotransmissão glutamatérgica, gabaérgica e serotoninérgica são alvos estratégicos importantes para os tratamentos de déficits cognitivos e emocionais. Neste sentido, este trabalho tem como objetivo a análise da expressão proteica dos receptores glutamatérgicos do tipo NMDA (subunidades NR2B e NR2A), Gabaérgicos do tipo GABAA e serotoninérgicos do tipo 5-HT1A no hipocampo dorsal (HD), no complexo amigdaloide (CA) e no córtex pré-frontal (CPF) de ratos submetidos à aquisição e a extinção da resposta emocional condicionada (REC) e ao tratamento agudo com o EGb. No experimento I será avaliada a participação dos diferentes sistemas nas diferentes etapas da formação da memória do medo condicionado a partir das análises dos encéfalos de animais tratados e controles, proveniente de estudo anterior. Ratos, Wistar, adultos foram tratados com uma única dose do EGb (250mg.Kg-1, 500 mg.Kg-1 ou 1000 mg.Kg-1) e/ou antagonistas específicos dos receptores glutamatérgico do tipo NMDA-NR2B (RO 256981, 10 mg.Kg-1), do tipo GABAA (Picrotoxina, 0,75 mg.Kg-1) e serotoninérgicos do tipo 5-HT1A (SWAY 100135, 0,3 mg.Kg-1) ou agonistas (NMDA, Diazepam e Buspirona) e as soluções veículos (Tween ou salina) antes do treino ou testes realizados 48 (Teste 1), 72 (Teste 2), ou 96 horas (Teste 3) após o condicionamento. As análises da expressão proteica, por imunohistoquímica, no HD, CA e CPF de ratos serão realizadas em encéfalos de ratos obtidos 24 horas após a evocação da memória do medo (Teste 1), ao Treino da extinção (Teste 2) ou a evocação da extinção (Teste 3). Os encéfalos dos animais foram perfundidos com solução de formalina 4%, retirados, crioprotegidos e congelados. Para isso, serão utilizados anticorpos contra subunidades especificas dos receptores em estudo (anti-NR2A, anti-NR2B, anti-5-HT1A e anti-GABAA) e da via de sinalização da ERK1/2 (anti-ERK1/2. Ainda, a identificação da célula neural (astrócito ou neurônio), envolvida nas alterações neuroquímicas sugeridas, poderá ajudar a esclarecer os fenômenos envolvidos. Assim, a utilização de anticorpos contra a proteína ácida fibrilar glial (anti-GFAP) ou contra neurofilamento (anti-NF) combinada à análise de expressão dos receptores, por meio da técnica de imunofluorescência de dupla marcação, permitirá a análise da interação entre os tipos celulares e a expressão diferencial das dos receptores. O experimento II tem como objetivo confirmar a participação do HD na aquisição e na manutenção da resposta de supressão condicionada, proposta pelo grupo, e identificação dos prováveis mecanismos celulares relacionados à formação da memória do medo e modulação do EGb. Serão retiradas amostras do HD de animais controles e submetidos à REC ou ao tratamento com EGb 24 horas ou 40 dias após o teste1. As amostras serão armazenadas a -80ºC para análise do produto proteico pela proteômica, avaliada através da técnica de eletroforese bidimensional acoplada a espectrometria de massa do tipo MALDI-TOF. Para a identificação das diferenças quantitativas das proteínas entre amostras de tecidos será utilizado software de imagens e os picos gerados pelo espectrômetro de massas... (AU)