Caracterização molecular da via de sinalização celular mediada pela proteína Quinase C no fungo patogênico humano Aspergillus fumigatus

Resumo

A. fumigatus é um fungo filamentoso saprofítico e ubíquo com um papel fundamental na reciclagem de carbono e nitrogênio na natureza. Entretanto ele é responsável pela vasta maioria dos casos de Aspergilose, embora ainda não seja compreendida a razão pela qual esta espécie se tornou um dos patógenos oportunistas mais predominantes. Aparentemente, os fatores envolvidos na sobrevivência desse organismo no ambiente extra-hospedeiro contribuem para o seu sucesso como um patógeno oportunista. Para se adaptar às mudanças do meio ('fitness') e para a manutenção de um estado de homeostasia, os microrganismos desenvolveram um sofisticado sistema regulatório que controla as respostas celulares durante a adaptação ambiental transduzindo um sinal externo para proteínas efetoras de resposta. Nesse contexto, a proteína quinase C (PKC), uma serina/treonina quinase desempenha um papel central na transdução do sinal. A. fumigatus apresenta dois homólogos de PKC denominados pkcA e pkcB, identificados por análise de similaridade. Entretanto, nesse organismo pouco é conhecido sobre o papel da via PKC/MAPK (MAP quinase) na transdução do sinal uma vez que experimentos funcionais não foram ainda conduzidos. Embora a via PKC1/MAPK tenha sido exaustivamente estudada em S. cerevisiae, em A. fumigatus sua relação com a patogenicidade/virulência e seu papel no sensoriamento e adaptação ambiental do fungo durante a infecção ainda não foi identificado. Dessa forma, o presente projeto propõe o estudo da via de transdução do sinal mediada pelas proteínas PkcA-B em A. fumigatus visando o estabelecimento de uma relação destas proteínas com os aspectos essenciais da virulência/patogenicidade nesse organismo. Para tanto, será realizada a caracterização funcional dos genes pkcA-B através dos seguintes objetivos: a) isolamento de linhagens mutantes nulos, condicionais e fusões com proteínas fluorescentes; b) identificação e caracterização de genes cuja expressão é influenciada por pkcA-B em A. fumigatus, utilizando-se a técnica de microarray para explorar o perfil transcricional de expressão global e, análise proteômica através do experimentos de eletroforese SDS-PAGE bidimensionais comparativos; c) busca de parceiros proteicos de pkcA-B utilizando uma combinação de abordagens bioquímicas e d) verificação do envolvimento de pkcA elou pkcB nas vias de integridade da parede celular (CWI) e HOG (High Osmolarity Glycerol) mediante exposição da célula a vários tipos de agentes estressores. Essa pesquisa pode em termos práticos revelar alvos quimioterápicos potenciais. Além disso, a identificação de novos alvos de pkcAlB a partir do estudo dessas vias irão proporcionar novos conceitos a respeito da biologia e dos mecanismos de transdução do sinal em Aspergilli e principalmente em A. fumigatus. (AU)