Estudo do ciclo celular das células de tumores adrenocorticais: análise da expressão de oncogenes e genes supressores de tumores, e da proliferação através da ação de quimioterápicos

Resumo

Tumores adrenocorticais tem incidência bimodal, antes dos 5 anos e depois dos 40- 50 anos. Os carcinomas adrenocorticais são raros e agressivos, com incidência de 0,05 a 0,2% de todos os tipos de câncer, porém, no Brasil, estes índices são maiores no Sul e Sudeste do país devido à ocorrência de uma mutação no gene supressor de tumor, o gene p53. Mesmo com a utilização de critérios padronizados, ainda há dificuldade em se diferenciar adenomas de carcinomas, principalmente nos pediátricos. Apesar da existência de alguns marcadores moleculares esses não são suficientes para o diagnóstico e prognóstico preciso da doença, e poucos são os modelos biológicos existentes para o estudo dos mecanismos e da sinalização celular desses marcadores. Portanto, por serem raros e possuírem diversas manifestações clínicas, a utilização de culturas de células é uma valiosa ferramenta que pode contribuir para o estudo dos processos fisiopatológicos, responsáveis pela gênese e progressão dos carcinomas. Nossa hipótese é que novos marcadores podem ajudar na classificação desses tumores, de maneira que analisaremos a expressão de oncogenes e genes supressores de tumor das células obtidas de adenomas, carcinomas, metástases, recidivas, de pacientes adultos e pediátricos, que apresentam diferentes características e contextos clínicos, utilizando placas de PCR array. Além disso, essa placas permitem a análise da expressão de genes da família Jun (Jun, JunB e JunD), que compõem o fator de transcrição AP-1, e que é importante na regulação do ciclo celular. A validação dos genes diferencialmente expressos ocorrerá pela análise da síntese proteica por "immunoblotting" e/ou imunocitoquimica. Além disso, as culturas serão testadas quanto à capacidade de síntese e secreção de esteroides no meio de cultura, através da utilização de kits comerciais específicos. Somado à hipótese anterior testaremos também se novas alternativas de quimioterápicos, em combinação ou não com o mitotano, podem inibir a proliferação celular de tumores adrenocorticais. Para testar a resposta destas drogas in vitro avaliaremos a resposta citotóxica de linhagens e culturas de células de tumores adrenocorticais, em monocamada (2D) e em esferoides (3D) que serão expostos a diferentes quimioterápicos, em concentrações e combinações variadas. Utilizaremos ensaios que se complementam e analisam a viabilidade e morte celular, como ensaio de MTS, ensaio de exclusão por azul de trypan, citometria de fluxo e TUNNEL. Nessa etapa esperamos padronizar um protocolo de fácil preparação e reprodutível para tratamento e análise de rotina de quimioterápicos de células de tumores adrenocorticais obtidos de pacientes em culturas em monocamada e principalmente em esferoides, que representam melhor o ambiente tumoral. Em resumo, nesse projeto espera-se aumentar o número de ferramentas disponíveis para o estudo de diferentes aspectos das doenças proliferativas adrenocorticais, tais como mecanismos da tumorigênese, controle da esteroidogênese, mecanismos de resistência a quimioterápicos, e até mesmo mecanismos de disseminação metastática. (AU)