Sequenciamento do genoma da serpente Bothrops jararaca para caracterização da estrutura gênica de toxinas e seus elementos regulatórios

Resumo

A maioria dos estudos envolvendo venenos de serpentes baseou-se em abordagens como a Bioquímica tradicional e a Biologia Molecular, contribuindo para diversos campos das ciências biológicas, tais como farmacologia, imunologia e biologia evolutiva. As técnicas de caracterização global, como a proteômica e a transcriptômica, enriqueceram este conhecimento ao indicar a complexa organização gênica das famílias de toxina e a presença de processos evolutivos moleculares importantes, como evolução acelerada, exon shuffling, convergência funcional, retrotransposição, etc. Surpreendentemente, apesar de todo o conhecimento adquirido, a base molecular dos genomas das serpentes é pouquíssimo conhecida. Mesmo em tempos de Sequenciamento de Nova Geração (NGS), nenhum genoma de serpente venenosa, brasileira ou não, foi resolvido. Além disso, o grupo "Squamata" (cobras e lagartos) mantém-se particularmente pouco explorado quando comparado aos diversos grupos de vertebrados como aves, mamíferos e peixes que dispõem de vários genomas resolvidos. Assim, propomos neste projeto realizar o sequenciamento com alta cobertura do genoma de uma serpente, tendo como modelo Bothrops jararaca - a espécie de maior importância médica no Brasil. Para tanto, devemos primeiro construir bibliotecas tipo shotgun e mate-pair para realizar corridas de Sequenciamento de Nova Geração (NGS) usando a tecnologia Illumina em aparelho HighScanSQ (na UNESP-Jaboticabal). As bibliotecas mate-pair serão construídas usando fragmentos de diferentes tamanhos visando um melhor mapeamento, conforme demonstrado para a resolução de genomas de outros vertebrados. Sequências complementares mais longas (> 400pb) serão obtidas pela tecnologia 454 em equipamento Roche-GSFLX (no LNCC, Petrópolis). Bibliotecas em BAC também serão construídas e sequenciadas em um equipamento 454-GSJunior (disponível no Lab. Especial de Toxinologia Aplicada do Instituto Butantan), a fim de se obter segmentos mais longos e contínuos do genoma. Esses BACs poderão ser escolhidos de forma aleatória ou selecionados com sondas contra cDNAs de toxinas de interesse. Todas as sequências geradas serão montadas para produzir contigs e scaffolds do genoma. Esses permitirão que obtenhamos um grande conjunto de segmentos genômicos que poderão ser selecionados in silico. Com isso, esperamos identificar e caracterizar genes de toxinas, genes envolvidos na produção e secreção do veneno, elementos retrotransponíveis e outros elementos relevantes para a evolução do sistema venenífero. A identificação de tais elementos deve constituir uma importante contribuição para a área da Toxinologia. Além disso, o conjunto de dados de segmentos do genoma será disponibilizado publicamente, permitindo o acesso a qualquer um que esteja interessado em outros aspectos da biologia das serpentes. A ausência de dados genômicos de serpentes prejudica a utilização das tecnologias mais avançadas, uma vez que atualmente a existência de um "genoma de referência" constitui-se quase em uma regra para a análise molecular. Como exemplos diretos, podemos citar alguns campos de nossa pesquisa que são limitados, como a caracterização proteômica de moléculas de veneno, a obtenção de sondas para análise da expressão gênica na glândula por PCR em tempo real ou microarray; a compreensão de mecanismos de evolução propostos para toxinas; a previsão de alvos para microRNA, entre outros. Além disso, em um contexto de pesquisas cada vez mais baseadas em NGS, é importante para um grupo como o nosso, que tem trabalhado com transcriptômica de venenos nos últimos dez anos, obter uma expertise em análise genômica e sequenciamento de alta cobertura. (AU)