Redes de regulação pós-transcricional por proteínas de ligação a RNA em células tronco embrionárias humanas

Resumo

Proteínas de ligação a RNA (ou RNA binding proteins - RBPs) controlam uma série de eventos celulares pós-transcricionais como splicing alternativo, transporte de pré-mRNAs para fora do núcleo celular, estabilização de mRNAs e a via de microRNAs. Mutações ou alterações na expressão de RBPs vêm sendo associadas a estados patológicos como distrofia muscular miotônica, autismo e Parkinson. Além disso, várias RBPs regulam a manutenção da pluripotência de células tronco e processos envolvidos na diferenciação celular. No entanto, ainda se sabe pouco sobre a função das RBPs na escolha e na regulação de mRNAs-alvo. Neste projeto propomos combinar técnicas moleculares e bioinformática para estudar os complexos nos quais RPBs estão envolvidas e para identificar e caracterizar seus mRNAs-alvo. Propomos estudar 5 RBPs relacionadas `a manutenção do estado pluripotente e a diferenciação neuronal a partir de células tronco humanas, contribuíndo para o entendimento de doenças neurológicas. Iremos caracterizar complexos protéicos formados por RBPs através de imunoprecipitação combinada com espectrometria de massa, utilizando-se superexpressão de RBPs em células HEK293. Ao mesmo tempo, propomos estudar o estado pluripotente de células tronco embrionárias humanas empregando a técnica de CLIP-seq (crosslinking de células seguida de imunoprecipitação da RBP e seleção de mRNAs ligados a proteína) para identificar os mRNAs-alvo de RBPs. Os dados de CLIP-seq também serão utilizados para identificar sítios de ligação da proteína aos mRNAs, combinando ferramentas computacionais. Pretendemos validar eventos regulatórios pós-transcricionais em células tronco embrionárias humanas comparativamente com células neuronais derivadas das primeiras. (AU)