Transformação genética de Citrus sinensis e Citrus reticulata para resistência a Candidatus liberibacter spp.

Resumo

A citricultura tem sido afetada por diversos problemas fitossanitários que interferem em sua produtividade. A doença Huanglongbing (HLB), associada à bactéria Candidatus Liberibacter spp., que coloniza os vasos do floema, foi constatada nos pomares brasileiros e tem provocado grandes prejuízos à cultura. Uma alternativa para o controle desta doença é a obtenção de cultivares resistentes, por meio de transformação genética. O Laboratório de Biotecnologia Vegetal, do CENA/USP, vem trabalhando com transformação genética de citros desde 1999 e recentemente iniciou trabalhos para obtenção de plantas transgênicas de laranja doce e tangerinas, expressando genes que possam influenciar a resistência a HLB. Para atingir este objetivo, estão sendo utilizadas construções gênicas com promotores específicos para a expressão gênica no floema (AtSut, AtPhP2 e CsPhP2), controlando genes antibacterianos ou antimicrobianos como atacina A, D4E1 e defensina 1 dos citros. No momento, possuímos plantas de laranja doce, cultivares 'Hamlin', 'Valencia' e 'Pera' expressando os genes atacina A e D4E1 sob o controle dos promotores AtSut ou AtPhP2, aclimatizadas em condições de casa-de-vegetação. Recentemente, obtivemos novas construções gênicas com o promotor CsPhP2 associado ao gene atacina A e o promotor AtSut associado ao gene defensina 1 dos citros. Assim, o objetivo deste projeto de pesquisa é avaliar a resistência ao HLB das plantas transgênicas já aclimatizadas e obter novas plantas transgênicas de laranja doce e tangerinas (variedades 'Fremont', 'Nules' e 'Thomas'), com as construções gênicas que temos disponíveis. A transformação genética será realizada via Agrobacterium tumefaciens, contendo o plasmídeo pCAMBIA 2201 com o cassete de expressão. Para os experimentos de transformação genética será utilizado como explante, segmentos de epicótilo obtidos de plântulas cultivadas in vitro. A identificação das gemas adventícias transgênicas será realizada por análise de PCR. As plântulas identificadas como transgênicas por PCR serão aclimatizadas e posteriormente transferidas para casa-de-vegetação específica para o cultivo de plantas transgênicas. Análises de 'Southern' e 'Northern' blot serão realizadas nas plantas PCR positivas aclimatizadas, para confirmação da integração e transcrição do transgene. As linhagens de plantas transgênicas serão inoculadas com Candidatus Liberibacter asiaticus e analisadas por PCR quantitativo para avaliação do nível de resistência. (AU)