Caracterização dos mecanismos moleculares do reparo de quebra de duplas fitas no DNA mitocondrial

Resumo

Nosso grupo desenvolve um projeto em colaboração com o Dr. Carlos Moraes visando caracterizar bioquimicamente a via de reparo de quebras de fitas duplas em DNA em mitocôndrias de células de mamíferos. Para identificarmos as proteínas necessárias para essa via de reparo, estamos utilizando um desenho experimental em que uma única quebra de fita dupla é introduzida no DNA mitocondrial in situ, através da expressão controlada de uma enzima de restrição bacteriana que foi modificada para ser expressa corretamente em células de mamíferos, e que contém um peptídeo sinal para a localização mitocondrial. Esse sistema permite uma caracterização mais específica das proteínas que se ligam ao sítio da quebra, uma vez que sabemos exatamente em qual sequência de DNA a quebra foi introduzida. Essa endonuclease foi desenvolvida pelo grupo do Dr. Moraes, e o plasmídeo de expressão já foi enviado ao nosso grupo. A aluna Valquiria Tiago Santos está agora transferindo o gene da enzima para o vetor adequado para a expressão no nosso sistema celular. Durante sua visita ao laboratório, o Dr. Moraes irá trabalhar com a aluna para agilizarmos a introdução das quebras. No primeiro dia da visita, iremos discutir os resultados obtidos até agora e desenhar uma nova estratégia experimental para garantir a expressão adequada da enzima. No segundo e terceiro dia, eles irão realizar o experimento de indução da enzima e verificação da indução da quebra observando o padrão de migração do mtDNA em gel de agarose. (AU)