A replicação do DNA em tripanossomas: caracterização das forquilhas de replicação e identificação de origens de replicação em Trypanosoma brucei

Resumo

Nosso laboratório estuda a replicação do DNA em tripanossomas. A replicação do DNA genômico inicia-se com a formação da maquinaria de pré-replicação em regiões do DNA denominadas origens de replicação. As origens de replicação, reconhecidas pela maquinaria de pré-replicação, não estão definidas em eucariontes (à exceção de S. Cerevisiae). Além disso, os mecanismos que fazem diferentes origens serem disparadas em diferentes momentos e ciclos celulares também não estão determinados. Assim, a caracterização dos eventos de replicação de DNA em diferentes organismos eucariontes é importante não só para o conhecimento da biologia destes organismos, mas também para se enriquecer o conhecimento desta área da biologia ainda pouco explorada. Este projeto pretende analisar moléculas isoladas de DNA de Trypanosoma brucei para caracterizar (i) a velocidade e direção das forquilhas de replicação, (ii) a localização e freqüência das origens de replicação em fragmentos específicos. Para tanto, utilizaremos a metodologia denominada SMARD (Single Molecule Analysis of Replicated DNA). Nesta técnica, as moléculas de DNA que foram replicadas são marcadas em dois pulsos consecutivos com análogos distintos de timidina. O DNA é extraído, digerido com enzimas de restrição específicas e o fragmento desejado é isolado em gel de eletroforese de campo pulsado (PFGE). As moléculas são então esticadas em lâminas e hibridizadas com sondas específicas para identificação da molécula e orientação da fibra de DNA. Esta técnica permite visualizar origens de replicação, términos de replicação e forquilhas em andamento. Pretendemos neste projeto analisar três fragmentos de 300 kb de DNA cuja sobreposição corresponde ao cromossomo I de T. brucei. Nesta análise buscaremos avaliar se a velocidade da forquilha de replicação é constante em todo o cromossomo ou se difere no centro ou extremidades do mesmo. Mais que isto, pretendemos avaliar o número de origens de replicação e se estas localizam-se em regiões específicas ou dispersas pelo cromossomo. Além disto, em colaboração com o Dr. Richard McCulloch (University of Glasgow), foram identificadas sequências no cromossomo IV de T. brucei que interagem com o componente da maquinaria de pré-replicação de tripansomas, Orc1/Cdc6. Este projeto pretende também validar, através de SMARD, quais das sequências que interagem com Orc1/Cdc6 são, de fato, origens de replicação. Assim, este projeto pretende dissecar molecularmente o mecanismo de replicação de DNA de tripanosomas, estabelecendo no laboratório a técnica de SMARD, que ainda não está sendo executada nos laboratórios brasileiros. (AU)