Expressão gênica e potencial de desenvolvimento in vitro dos complexos cumulus-oócitos ovinos tratados com roscovitina

Resumo

A maioria dos COCs destinados à produção in vitro de embriões (PIV) ainda não completou seu desenvolvimento e, portanto, não possui adequado estoque de mRNAs e proteínas essenciais para suportar os posteriores estádios do desenvolvimento. Neste contexto, a manutenção temporária do oócito no estádio de vesícula germinativa com uso de inibidores da meiose consiste numa estratégia para incrementar o potencial de desenvolvimento oocitário e embrionário in vitro. Deste modo, esta pesquisa propõe avaliar o padrão de expressão dos genes GLUT1, SOD, MATER, ZAR1, BMP15, GDF9, nos oócitos, e GREM1, PTX3, PTGS2, ALK5, ALK6, BMPRII nas células do cumulus, considerados fundamentais para aquisição de competência oocitária e funcionalidade das células do cumulus, de complexos cumulus-oócitos (COCs) de ovinos tratados com roscovitina (inibidor específico das quinases dependentes de ciclina); e avaliar o potencial destes COCs em se desenvolver em embriões viáveis após a reversibilidade da ação inibitória da roscovitina. Para isso, folículos com diâmetro entre 2 e 5mm de ovários de ovelhas, obtidos em frigorífico, serão aspirados e COCs grau 1 e 2 serão cultivados, por 20 horas, em meio de maturação padrão (Grupo Controle) acrescido de 75¼M de Roscovitina (Grupo Tratamento) a 38,5ºC em 5% de CO2 em ar. Para reversibilidade da ação inibitória da roscovitina e progressão da meiose, os COCs serão cultivados por mais 18horas em meio de maturação livre de inibidores, nas mesmas condições acima descritas. Antes e após 20 e 38 horas de cultivo in vitro, COCs de ambos os grupos experimentais serão avaliados quanto à expansão das células cumulus, em estereomicroscópio, quanto à maturação nuclear, em microscópio de fluorescência, e quanto à expressão gênica no oócito e nas células do cumulus, através qRT-PCR. Parte dos COCs do Grupo Controle e do Grupo Tratamento, após 20 e 38horas de cultivo in vitro, respectivamente, será destinada à fertilização e cultivo embrionário in vitro e os embriões obtidos serão avaliados quanto ao estádio de desenvolvimento e qualidade, em estereomicroscópio, e viabilidade, em microscópio de fluorescência. (AU)