Criotolerância de embriões bovinos produzidos in vitro: efeitos da tensão de oxigênio e da suplementação do meio com antioxidantes em diferentes etapas do cultivo

Resumo

É sabido que tanto a tensão de oxigênio como a presença de antioxidantes tem efeito sobre o desenvolvimento do embrião produzido in vitro. Visando melhorar a qualidade, o desenvolvimento e o sucesso da criopreservação de embriões bovinos, este estudo tem como principal objetivo promover modificações em algumas etapas do sistema de cultivo in vitro. Para tanto, nos propomos a avaliar o efeito da tensão de oxigênio e da suplementação com antioxidante nos meios de maturação in vitro (MIV) e/ou cultivo in vitro (CIV) de embriões frescos e após vitrificação. Para tanto, em uma primeira etapa, os oócitos serão maturados in vitro em meio TCM-199 Bicarbonato (B-199) em temperatura de 38,5°C, atmosfera gasosa de 5% de CO2 e umidade de 100%, por 22 horas. Em seguida à MIV, os oócitos serão fecundados e os prováveis zigotos serão cultivados por 7 dias (168 hpi) em meio SOf suplementado com 0,6 mM de cisteína (CIST), ou 100 µM de ²-mercaptoetanol (²-ME) ou 100 UI de catalase (CAT), ou ainda sem suplementação com antioxidantes (SOF - Controle). O CIV será conduzido em incubadora com atmosfera gasosa de 5% de CO2 em ar (20% de O2) ou em atmosfera com mistura controlada de gases (7% de O2, 5% de CO2 e 88% de N2). Serão avaliadas a clivagem (72 hpi) e o desenvolvimento embrionário até a fase de blastocisto após 144 e 168 hpi, quando serão vitrificados ou avaliados quanto a presença de ROS. Posteriormente, os embriões serão descongelados e cultivados in vitro para avaliação da taxa de re-expansão e de eclosão. A atmosfera gasosa que proporcionar melhores resultados (em quantidade ou qualidade de embriões) será utilizada na segunda etapa do projeto. Nesta, os oócitos serão maturados in vitro em meio B-199 (CONTR) ou meio CIST, ou meio ²-ME, ou meio CAT, em atmosfera de 5% de CO2 em ar, temperatura de 38,5°C e umidade de 100%, por 22 horas. Em seguida serão fecundados e os prováveis zigotos serão CIV por 7 dias (168 hpi), em meio suplementado com os mesmos ou nenhum dos mesmos antioxidantes utilizados durante a MIV, em atmosfera gasosa definida na primeira etapa (5% CO2 ou 7% O2). Serão avaliadas a clivagem (72 hpi) e o desenvolvimento embrionário as 144 e 168 hpi, quando os mesmos serão vitrificados ou avaliados quanto a sua qualidade (presença de ROS ou taxa de apoptose). Posteriormente os embriões serão descongelados e cultivados in vitro para avaliação da taxa de re-expansão e de eclosão e da qualidade embrionária pela determinação do numero total de células. (AU)