Migração e invasão tumoral mediadas pelo gene RECK em modelo de melanoma

Resumo

Os melanomas apresentam extrema quimioresistência e pior prognóstico, com uma taxa de sobrevida de 6 meses, portanto, novas estratégias terapêuticas são necessárias. As células deste tipo de tumor acumulam alterações na expressão gênica que contribuem para a proliferação descontrolada, evasão de senescência e inibição de morte celular em múltiplas rotas intracelulares. O gene RECK é expresso em diversos tecidos humanos normais, porém, sua expressão é reprimida durante a transformação celular. Estudos demonstram a correlação inversa entre a expressão de RECK e MMPs, e a sua relação com invasividade e mobilidade celular, em linhagens tumorais. Toda literatura gerada até o presente momento relata a possibilidade de utilização deste gene como marcador molecular para prognóstico de tumores do tipo carcinoma pancreático, mamário, hepatocarcinoma, pulmão, colo-retal e até mesmo como terapia gênica em doenças degenerativas. Nosso laboratório tem explorado o gene RECK em diversos tumores, como gliomas e carcinomas cervicais uterinos (Sasahara et al., 2002; da Silva Cardeal et al., 2006; Corrêa et al., 2006 e 2010). Além disso, contamos com modelos que reorganizam o microambiente tumoral in vitro, uma ferramenta valiosa, onde reconstruímos a pele ou estratos teciduais, e simulamos a invasão tumoral na derme cultivando esta estrutura com células de melanoma. Nossa proposta de estudo, portanto, visa caracterizar amplamente o mecanismo de ação de RECK em monocamadas e em culturas de pele artificial. Esse modelo 3D, também conhecido como cultura organotípica, já utilizado em outros modelos de diferentes tipos de tumores, incluindo mama, próstata e melanoma. Através deste modelo, é possível estimar o potencial terapêutico de algumas drogas, manipulação de genes além de terapias não convencionais.Objetivamos, portanto, avaliar os efeitos de RECK em linhagens de melanomas metastáticos humanos (SK-Mel) quando em monocamadas ou em modelo de pele artificial a fim de avaliar parâmetros envolvidos em migração e invasão celular. A metodologia utilizada para o estudo funcional desses genes nas linhagens de melanoma humano metastático será o silenciamento por shRNA nas linhagens de melanoma e superexpressão em melanoma humanos por transfecção lentiviral comparando-se aos melanócitos. Ensaio de zimografia será utilizado para verificar a atividade das MMPs 2 e 9, importantes no processo invasivo destes tumores. Ensaios de invasão transwell em câmara de boyden serão utilizados para verificar a modulação da invasão in vitro por esses genes. Avaliação das expressões gênicas e protéicas dos alvos de interesse serão realizadas por meio de Real Time PCR e Western Blotting, respectivamente. Em cortes da pele artificial, imunohistoquímica para componentes de invadopódio serão utilizados para verificar o papel deste gene no processo invasivo. Imunocitoquimica para componentes do citoesqueleto e adesão focal serão utilizados para esclarecer a função de RECK na motilidade celular. Ensaios de tumorigenicidade in vivo verificarão a formação, crescimento, progressão e capacidade de induzir a metástase de células que possuem RECK superexpresso ou inibido. Sendo assim, devido à importância deste gene e a falta de marcadores na progressão do melanoma, bem como a ineficiência dos tratamentos vigentes, propomos a avaliação da expressão de RECK como um possível marcador em melanomas, e também a sua importância na invasão e progressão tumoral, podendo ser utilizado futuramente em terapias gênicas para o tratamento de melanomas. (AU)