Desenvolvimento e validação do teste de aglutinação em látex (LAT) para diagnóstico do vírus da cinomose canina ou preparo do RNA para aplicação direta na RT-qPCR

Resumo

A cinomose é uma doença que acomete animais carnívoros, com maior importância econômica relacionadas à infecção em cães e se apresenta de forma enzoótica no mundo inteiro. Considerando a natureza contagiosa e as altas taxas de mortalidade de cães infectados pelo CDV torna necessário o desenvolvimento de ferramentas para o diagnóstico acessível da doença. Atualmente, a RT-PCR e RT-qPCR seguidas da NESTED-PCR a partir de amostra de urina são utilizadas para o diagnóstico da doença. Porém essas técnicas apresentam como limitação o custo, o tempo e o risco de contaminação. O teste de aglutinação em látex (LAT) é um método diagnóstico que tem sido aplicado em uma ampla variedade de testes analíticos para diagnóstico de infecções por ser um método simples, rápido, específico e de baixo custo e até o presente momento não foi desenvolvido para o diagnóstico da cinomose canina, provavelmente pelo baixo limiar de detecção. Contudo, vários procedimentos podem ser utilizados para otimização do LAT visando o aumento da sensibilidade do teste. Para este propósito, serão testados anticorpos provenientes de vários animais sob várias condições de ligação látex-anticorpo (concentração de látex e anticorpo, pH e tempo). Adicionalmente o látex será conjugado previamente pela proteína A para posteriormente serem conjugados aos anticorpos de mamíferos. Entretanto, o resultado do LAT pode ser dependente da carga viral da amostra, portanto nas amostras que não houver aglutinação visível, o ensaio será utilizado para concentração/extração de ácido nucléico viral, assim como outras técnicas já descritas que utilizam partículas ligadas para essa finalidade, com objetivo de aumentar a sensibilidade da reação de RT-qPCR. Muito provavelmente essa tecnologia eliminará a etapa de extração de RNA viral e NESTED-qPCR, reduzindo custos, otimizando o tempo de reação e permitindo maior segurança em relação a contaminação do laboratório. O objetivo do presente projeto é desenvolver, padronizar e validar um novo método de detecção por captura e aglutinação para o diagnóstico rápido da cinomose canina em amostras com alta carga viral ou como preparo do RNA viral para uso na RT-qPCR para uso na RT-qPCR. (AU)