Avaliação das citocinas VEGF, TNF-a, RANKL e OPG no reparo de defeito ósseo em calvária de ratos diabéticos tratados com matriz óssea desmineralizada

Resumo

Estudos têm demonstrado que a Diabetes Mellitus favorece a perda óssea, sendo comum a osteopenia da cabeça do fêmur e/ou da espinha lombar, bem como a osteoporose, além de apresentar efeitos negativos também durante o reparo de fraturas, como a redução da angiogênese e do suprimento sanguíneo, resposta inflamatória severa, diminuição na síntese de colágeno, distúrbio no processo de mineralização e um desequilíbrio entre a reabsorção óssea pelos osteoclastos e a deposição da matriz pelos osteoblastos. Neste caso, a participação de duas moléculas sinalizadoras tem papel essencial: o fator de necrose tumoral alfa (TNF-alfa) que promove a expressão do ativador do receptor para fator nuclear-kB ligante (RANKL) pelos linfócitos T, linfócitos B, células endoteliais e osteoblastos. A molécula de RANKL, por sua vez liga-se ao seu receptor RANK, localizado na superfície das células precursoras, promovendo sua diferenciação em osteoclastos. Para controlar a osteoclastogênese, a molécula receptora osteoprotegerina (OPG) compete com a ligação do RANKL pelo receptor RANK, ligando-se diretamente ao RANKL, impedindo a diferenciação das células progenitoras de osteoclastos. Por último, o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) promove a angiogênese, sendo um pré-requisito para o recrutamento local de células precursoras de osteoclastos e osteoblastos durante a formação óssea e o reparo. Por outro lado, os enxertos ósseos alógenos (MAOD), oriundos de um indivíduo doador da mesma espécie que o receptor, mas com genótipo diferente, tem sido uma alternativa no tratamento de extensos defeitos ósseos, devido sua capacidade osteocondutora e osteoindutora. Assim, o atual trabalho tem como objetivo verificar se a MAOD melhora o reparo de defeitos ósseos em ratos diabéticos e normoglicêmicos e se altera ou não a expressão do VEGF, RANKL e OPG e TNF-alfa. Para isso, serão utilizados 200 ratos machos Wistar com 90 dias de idade divididos em Grupo não diabétido (n = 100) os quais receberão uma dose de solução fisiológica a 0,9% e Grupo diabético (n = 100), os quais serão induzidos à diabetes pela aplicação de uma dose única intraperitoneal de estreptozotocina (47 mg/Kg). Após 7 dias os índices glicêmicos dos animais serão obtidos e apenas os que apresentarem em torno de 180 até 300 mg/dL serão enquadrados dentro do grupo diabético. Em seguida, serão realizados defeitos críticos de 8 mm de diâmetro nos ossos parietais, sendo que, no Subgrupo tratado (n = 50/grupo) os defeitos serão preenchidos com matriz alogênica óssea desmineralizada (MAOD) obtidas de fêmures de ratos doadores desmineralizados em HCl 0,6N, e o Subgrupo não tratado (n = 50/grupo) os defeitos serão preenchidos apenas com coágulo sanguíneo obtido do próprio animal por punção cardíaca. Ao término dos períodos experimentais de 0, 7, 14, 21 e 42 dias (10 animais de cada subgrupo/período) as calotas cranianas serão coletadas sendo 5 fixadas em formol a 10% e submetidas a processamentos histológicos para análise morfométrica e imunohistoquímica, e 5 serão trituradas, sendo metade acondicionada em Trizol e congelada para análise do RNAm pelo RT-PCR real-time e a outra metade apenas congelada para análise protéica pelo western blotting para o VEGF, RANKL, OPG e TNF-alfa. Diante das análises propostas, verificaremos: a) o volume de tecido ósseo neoformado em ambas as condições (diabéticos e normoglicêmicos) e tratamento (não tratado e o tratado com MAOD); b) a expressão da proteína VEGF e o padrão de vascularização e ossificação; e c) a cinética do número de osteoclastos/mm2 em ambas condições (diabéticos e normoglicêmicos) e tratamento (não tratado e o tratado com MAOD) e d) correlacionar a expressão das proteínas TNF-alfa, RANKL e OPG com a reabsorção da matriz. Com os resultados dessas análises verificaremos se a MAOD melhora o reparo de defeitos ósseos em ratos diabéticos e normoglicêmicos e se altera ou não a expressão do VEGF, RANKL e OPG e TNF-alfa. (AU)