Desenvolvimento de biossensor para detecção do vírus Epstein Barr (EBV) em saliva de pacientes HIV positivos

Resumo

O desenvolvimento de métodos analíticos rápidos, seguros e de baixo custo para diagnóstico e controle de doenças em humanos tem despertado grande interesse científico nas últimas duas décadas. O biossensores têm sido intensamente estudados e desenvolvidos devido à simplicidade de utilização e grande sensibilidade nos resultados, possibilidade de realização de diagnóstico de doenças infecciosas em tempo real, potencial substituinte de técnicas analíticas tradicionais, com várias etapas de análises, muitas vezes invasivas, ou com elevadas quantidades de amostras exigidas. Os biossensores que utilizam oligonucleotídeos imobilizados em nanopartículas de ouro (AuNP), método de autodetecção colorimétrica específica ao gene-alvo, despontam como uma tecnologia sensível, eficiente, de baixo custo e de fácil aplicação, que dispensam o uso de marcadores (enzimas e fluoróforos) e proporcionam análise em tempo real de hibridização, sem equipamentos especiais para a interpretação dos resultados. O vírus Epstein Barr (EBV) será investigado neste projeto por apresentar características evidenciadas cientificamente, como: elevada carga viral em saliva de pacientes imunocomprometidos; método de diagnóstico molecular bem estabelecido, PCR-nested, que será utilizado para avaliação do biossensor proposto; vírus oncogênico, relacionado a desordens proliferativas, de alta relevância para pacientes imunossuprimidos. Mediante o exposto, pretendemos desenvolver um biossensor com oligonucleotídeos tiolados imobilizados em AuNP para reconhecimento específico de parte do gene EBNA1 do EBV em saliva de pacientes HIV positivos atendidos no Centro de Atendimento de Pacientes Especiais da FOUSP. Métodos: Serão estudadas as melhores condições de imobilização dos oligonucleotídeos tiolados, complementares a regiões do gene EBNA1, em AuNP de 10 e 20 nm. Serão analisadas variáveis como: tempo de reação, temperatura e pH de soluções para otimização do processo de ancoragem dos oligonucleotídeos sobre a superfície de ouro das nanopartículas. Para esse estudo será utilizada a técnica de espectrofotometria, tendo como referencial o aumento da absorbância após a imobilização dos oligonucleotídeos sobre as AuNP. As condições idéias de hibridização do biossensor (oligonucleotídeos conjugados às AuNP) ao gene EBNA1 do EBV, bem como limite de detecção, sensibilidade e especificidade do biossensor, também serão estudadas. Os métodos de caracterização da hibridização entre o biossensor e o EBV-DNA serão os de visualização direta e espectrofotométrico, para detecção da diferença de coloração das reações, que representarão as etapas de agregação das nanopartículas, nos casos positivos, e não mudança de cor nos casos negativos. Serão coletados cerca de seis mililitros de saliva de 20 pacientes voluntários através do método de expectoração. Essas amostras serão armazenadas em nitrogênio líquido e, posteriormente, serão estocadas a -80 graus Celsius. Serão realizados estudos sobre lise celular e de capsídeo viral, utilizando reagentes de lise celular, descritos na literatura, em diferentes tempos de reação, temperatura e pH de soluções, para obtenção das melhores condições de disponibilidade do DNA viral para reconhecimento do biossensor, nos casos positivos para EBV. Os resultados positivos ou negativos gerados pelo biossensor, serão comparados com as respostas obtidas, da mesma amostra de saliva, através da técnica de PCR-nested. Resultados esperados: Almejamos desenvolver um método rápido, sensível, portátil e eficiente de diagnóstico precoce de EBV para auxiliar odontólogos e médicos no planejamento e monitoramento da infecção viral relacionada às desordens proliferativas e neoplásicas. Além do mais, pretende-se realizar o registro de propriedade intelectual do sistema de biossensor a ser desenvolvido, que caracterizará a inovação tecnológica pretendida neste projeto. (AU)