Projeto Genoma-FAPESP: laboratório de sequenciamento

Resumo

O desenvolvimento da tecnologia de sequenciamento automático de DNA em larga escala levou a uma mudança dramática no ritmo de identificação de genes. Há pouco tempo, alguns anos de trabalho eram necessários para identificar um único gene ou proteína de interesse. Hoje, pequenos genomas (menores que 2Mb) podem ser completamente sequenciados em menos de um ano. Enquanto em Dezembro de 1997, quando foi lançado o projeto Genoma de Xylella fastidiosa da FAPESP, existiam 12 genomas completos disponíveis publicamente (totalizando cerca de 36 Mb), em fevereiro deste ano (2000), quando se concluiu o sequenciamento da Xylella, eles já totalizavam 296 Mb em 28 genomas. A estratégia central prevista para o sequenciamento do genoma da Xylella fastidiosa era dividida em cinco fases (FAPESP, 1999): i. construção de um mapa físico do genoma bacteriano baseado em digestões com enzimas de restrição; ii. preparação de uma biblioteca de plasmídeos contendo insertos de aproximadamente 4 Kb, correspondendo a uma cobertura de 10 vezes o genoma total; iii. sequenciamento das extremidades dos clones da biblioteca de plasmídeos; iv. construção de uma biblioteca de cosmídeos, contendo insertos de aproximadamente 40 Kb; v. mapeamento da biblioteca de cosmídeos e ordenação dos clones a serem sequenciados. O rápido sucesso na construção, validação e mapeamento da biblioteca de cosmídeos, aliado à baixa qualidade das bibliotecas de plasmídeos fizeram com que os cosmídeos se transformassem na estratégia central do projeto. A abordagem shotgun foi empregada para elucidação das sequencias dos cosmídeos. A estratégia de sequenciamento com uso de bibliotecas shotgun, na forma como foi proposta originalmente (Anderson et al., 1982), compreende duas fases. A primeira, a fase shotgun, consiste no na geração de leituras de sequenciamento de subclones aleatórios. Nenhuma evidência existe sobre que região da sequencia do cosmídeo será coberta por um determinado subclone. A cada lote de leituras, tentativas de "agrupamento" (i.e., montagem) das sequencias obtidas até o momento são feitas. Duas ou mais leituras que se juntem em seqüências contíguas recebem o nome de contigo O aumento do número de leituras de uma biblioteca shotgun converge para a formação de um único contig, que representa a sequencia do cosmídeo original. Na fase seguinte, de finalização, a correção da montagem é inspecionada. Verificam-se ainda diversas anomalias de dados, tais como leituras contaminantes, presença de sequencia de vetores e leituras quiméricas. Nesta fase, a obtenção de novos dados passa a ser dirigida para regiões que ainda não seguem os padrões de finalização. Como já era esperado, embora mais de 95% do sequenciamento tenha sido concluído em pouco mais de 1 ano, a obtenção dos 5% restantes levou cerca de seis meses. Esta conclusão demandou o emprego de técnicas não previstas originalmente, como o uso de bibliotecas de fago lambda (λ). (AU)