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Efeito da insulina na inflamação pulmonar secundária a sepse, na imunidade inata, na ativação do seu gene (BGK) e seus receptores (IR-A e IR-B)

Processo: 10/02272-0
Modalidade de apoio:Auxílio à Pesquisa - Jovens Pesquisadores
Vigência: 01 de março de 2011 - 28 de fevereiro de 2015
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Imunologia - Imunologia Celular
Pesquisador responsável:Joilson de Oliveira Martins
Beneficiário:Joilson de Oliveira Martins
Instituição Sede: Faculdade de Ciências Farmacêuticas (FCF). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
Bolsa(s) vinculada(s):13/20904-1 - Estudo da expressão do receptor de Vitamina D em macrófagos alveolar e peritoneal em camundongos sadios e diabéticos, BP.IC
12/23998-4 - Influência da vitamina D na expressão de receptores (VDR e TLR) em macrófagos no modelo de Diabetes Mellitus Experimental, BP.MS
13/10307-6 - Estudo sobre a secreção de citocinas em modelo de peritonite induzida por carragenina em camundongos sadios e diabéticos, BP.IC
+ mais bolsas vinculadas 12/06617-7 - Papel da insulina na vigência da inflamação alérgica pulmonar em camundongos diabéticos e sadios, BP.MS
12/06652-7 - Aspectos celulares e moleculares envolvidos na resposta inflamatória induzida pela carragenina em camundongos sadios e diabéticos, BP.PD
11/12298-9 - A intervenção da Insulina na expressão de moléculas de adesão em modelo experimental de Sepse, BP.IC
10/20501-6 - Efeito da insulina na inflamação pulmonar secundária a sepse, na imunidade inata, na ativação do seu gene (²Gk) e seus receptores (Ir-A E Ir-B), BP.JP - menos bolsas vinculadas
Assunto(s):Imunidade  Inflamação  Sepse  Diabetes mellitus  Insulina 
Palavra(s)-Chave do Pesquisador:diabetes | inflamação pulmonar | Insulina | Lps | sepse | vias de sinalização | Imunidade e inflamação

Resumo

Na sepse por CLP, o LPS das bactérias Gram-negativas, contribui de forma importante para SARA, por ativação dos TLRs. O pulmão é um dos órgãos afetados na sepse e os MAs podem contribuir para SARA decorrente da sepse, liberando uma segunda onda de mediadores inflamatórios amplificando esta resposta. Nós encontramos recentemente que o LPS estimula em MAs de rato as vias de sinalização intracelular, induz a expressão de enzimas e que o pré-tratamento dos MAs com insulina inibiu todos estes efeitos do LPS. Resultados recentes em nosso laboratório mostram que a capacidade fagocítica de MAs de ratos diabéticos para alvos opsonizados por IgG está diminuída em comparação com MAs de animais sadios. Portanto, nossa hipótese de trabalho é a que insulina possa modular a inflamação e a imunidade inata no pulmão durante a sepse. Será utilizado um modelo de carência relativa de insulina. Assim, na primeira parte deste projeto pretendemos estudar a intervenção da insulina na inflamação pulmonar decorrente da sepse, analisando os mecanismos moleculares (produção/liberação de citocinas, expressão de moléculas de adesão e vias de sinalização envolvidas. Animais não-diabéticos com sepse grave receberão dose única (a ser definida) de insulina NPH, por via subcutânea, 8 horas antes do sacrifício ou diariamente durante 10 dias. Os níveis glicêmicos serão determinados antes e 8 horas após do tratamento com insulina. Em paralelo, será estudado o papel da insulina na imunidade inata no pulmão analisando a atividade fagocítica e microbicida dos MAs. Para tanto serão avaliados: a) o número de células no lavado broncoalveolar, o leucograma e a glicemia (monitor de glicose); b) os níveis sérico de corticosterona e insulina (ELISA); c) as concentrações de citocinas (ELISA); d) a expressão de moléculas de adesão no endotélio vascular (imunohistoquímica; e) o índice fagocítico e a atividade microbicida contra K. pneumoniae dos MAs (microscopia óptica); e f) a expressão das enzimas COX-2 e iNOS, das moléculas envolvidas na sinalização intracelular e a expressão do receptor TLR-4 no pulmão (Western blot). Sendo o diabetes uma das dez doenças que mais vitimam a população mundial, ampliar o conhecimento sobre a resposta inflamatória e imune conseqüente da sepse em indivíduos diabéticos é de fundamental relevância. A insulina regula o metabolismo celular modulando a atividade de proteínas envolvidas na sinalização intracelular. Entretanto, pouco se conhece sobre quais cascatas de sinalização a insulina age. Assim, a segunda parte deste projeto tem por objetivo avaliar a ativação que a insulina promove no seu próprio gene, "B Cell glucokinase gene" (BGK) e seus receptores (isoformas A e B). Inicialmente será feito o isolamento das células pancreáticas e dos MAs de ratos e em seguida, a transfecção com o gene para BGK e para os receptores de insulina (IR)-A e IR-B, para posterior cultura destas células. As células B serão estimuladas com 16.7 mM de glicose por 15 minutos ou com 50 mM de KCl e/ou com várias concentrações de insulina 5 minutos antes do estimulo com glicose. Os MAs serão estimulados com LPS (100 ng/mL) e/ou com várias concentrações de insulina 5 minutos antes do estimulo com LPS. Para a análise do RNA (BGK), as células B e os AMs serão coletados 1 hora após o estimulo, pela técnica de RT-PCR. Para a análise da atividade das proteínas kinases ou fosforilação da tirosina, células b serão monitoradas por microscopia confocal por até 240 minutos após o estímulo.Um melhor conhecimento de como a insulina atua na resposta inflamatória, nos receptores da imunidade inata, na ativação de seu próprio gene, em seus receptores e de como as diferentes vias de sinalização interferem umas com as outras permitiria contribuir não apenas para a discussão sobre o uso da insulina em pacientes com sepse grave, mas também para aumentar a imunidade natural contra microorganismos patogênicos ou inibir os efeitos deletérios da inflamação. (AU)

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Publicações científicas (15)
(Referências obtidas automaticamente do Web of Science e do SciELO, por meio da informação sobre o financiamento pela FAPESP e o número do processo correspondente, incluída na publicação pelos autores)
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RAJASEKARAN, SUBU SURENDRAN; ILLIES, CHRISTOPHER; SHEARS, STEPHEN B.; WANG, HUANCHEN; AYALA, THAIS S.; MARTINS, JOILSON O.; DARE, ELISABETTA; BERGGREN, PER-OLOF; BARKER, CHRISTOPHER J.. Protein kinase- and lipase inhibitors of inositide metabolism deplete IP7 indirectly in pancreatic beta-cells: Off-target effects on cellular bioenergetics and direct effects on IP6K activity. CELLULAR SIGNALLING, v. 42, p. 127-133, . (14/05214-1, 10/02272-0, 06/54691-0)
KNOX DE SOUZA, PAULA R.; FERREIRA, SABRINA S.; NUNES, FERNANDA P. B.; CASAGRANDE, FELIPE B.; TESSARO, FERNANDO H. G.; SILVA, MARIANA C. F.; MIRANDA COSTA CRUZ, JOSE WALBER; MAMIZUKA, ELSA M.; MARTINS, JOILSON O.. Cytokine and Adhesion Molecule Expression Induced by Different Strains of Staphylococcus aureus in Type 1 Diabetic Rats: Role of Insulin. FRONTIERS IN IMMUNOLOGY, v. 9, . (17/11540-7, 12/06652-7, 14/05214-1, 10/02272-0)
CASAGRANDE, FELIPE BECCARIA; FERREIRA, SABRINA DE SOUZA; BARBOSA NUNES, FERNANDA PEIXOTO; DAL'MAS ROMERA, LAVINIA MARIA; DOS SANTOS, SUELEN SILVANA; GALVAO TESSARO, FERNANDO HENRIQUE; KNOX DE SOUZA, PAULA REGINA; ALMEIDA, SANDRO ROGERIO; MARTINS, JOILSON OLIVEIRA. Insulin Modulates Paracoccidioides brasiliensis-Induced Inflammation by Restoring the Populations of NK Cells, Dendritic Cells, and B Lymphocytes in Lungs. JOURNAL OF DIABETES RESEARCH, . (17/11540-7, 12/06652-7, 14/05214-1, 12/06617-7, 10/02272-0)
GALVAO TESSARO, FERNANDO HENRIQUE; AYALA, THAIS SOPRANI; BELLA, LEONARDO MENDES; MARTINS, JOILSON OLIVEIRA. Macrophages from a type 1 diabetes mouse model present dysregulated P13K/AKT, ERK 1/2 and SAPK/JNK levels. Immunobiology, v. 225, n. 2, . (14/05214-1, 17/11540-7, 10/02272-0, 19/25999-7)
NOLASCO, EDUARDO L.; ZANONI, FERNANDO L.; NUNES, FERNANDA P. B.; FERREIRA, SABRINA S.; FREITAS, LUIZA A.; SILVA, MARIANA C. F.; MARTINS, JOILSON O.. Insulin Modulates Liver Function in a Type I Diabetes Rat Model. CELLULAR PHYSIOLOGY AND BIOCHEMISTRY, v. 36, n. 4, p. 1467-1479, . (14/05214-1, 10/02272-0)
BARKER, CHRISTOPHER J.; TESSARO, FERNANDO HENRIQUE GALVAO; FERREIRA, SABRINA DE SOUZA; SIMAS, RAFAEL; AYALA, THAIS S.; KOHLER, MARTIN; RAJASEKARAN, SUBU SURENDRAN; MARTINS, JOILSON O.; DARE, ELISABETTA; BERGGREN, PER-OLOF. XPR1 Mediates the Pancreatic beta-Cell Phosphate Flush. Diabetes, v. 70, n. 1, p. 111-118, . (14/05214-1, 10/02272-0, 17/11540-7)
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RAJASEKARAN, SUBU SURENDRAN; KIM, JAEYOON; GABOARDI, GIAN-CARLO; GROMADA, JESPER; SHEARS, STEPHEN B.; DOS SANTOS, KAREN TIAGO; NOLASCO, EDUARDO LIMA; FERREIRA, SABRINA DE SOUZA; ILLIES, CHRISTOPHER; KOHLER, MARTIN; et al. Inositol hexakisphosphate kinase 1 is a metabolic sensor in pancreatic beta-cells. CELLULAR SIGNALLING, v. 46, p. 120-128, . (14/05214-1, 10/02272-0, 17/11540-7)
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TESSARO, FERNANDO H. G.; AYALA, THAIS S.; NOLASCO, EDUARDO L.; BELLA, LEONARDO M.; MARTINS, JOILSON O.. Insulin Influences LPS-Induced TNF-alpha and IL-6 Release Through Distinct Pathways in Mouse Macrophages from Different Compartments. CELLULAR PHYSIOLOGY AND BIOCHEMISTRY, v. 42, n. 5, p. 2093-2104, . (14/05214-1, 17/15625-7, 12/23998-4, 10/02272-0)
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