Controle da replicacao do dna em trypanosoma cruz e trypanosoma brucei

Resumo

Nosso laboratório estuda o processo de duplicação do DNA em tripanosomas. A replicação do DNA requer precisão e especificidade. Para garantir este controle, a célula utiliza dois elementos genéticos. Uma seqüência de nucleotídeos, onde a duplicação do DNA inicia-se, e um complexo protéico (complexo de pré-replicação -CPR) capaz de reconhecer esta região do DNA como uma origem de replicação. Em leveduras é metazoários CPR está diretamente envolvido no controle da replicação. O objetivo deste projeto é buscar nos tripanosomas o mecanismo molecular que garante que o DNA seja inteiramente duplicado, mas somente uma única vez por ciclo celular. Nosso laboratório demonstrou que a molécula anotada no banco de dados do genoma de tripanosomas como ORC1, e por nós denominada Orc1/Cdc6, é um componente da maquinaria de pré-replicação de tripanosomas. Esta molécula apresenta uma atividade de ATPase que nos demais eucariontes está envolvido com o reconhecimento específico das origens de replicação e com a estabilização do CPR nas origens de replicação. Assim, nosso primeiro objetivo é avaliar, através da geração de mutantes que não apresentam o domínio de ligação ou o de hidrólise de ATP, o papel desta atividade na estabilização do CPR nas origens de replicação. O bloqueio da re-replicação é garantido pela oscilação da expressão ou da localização de Cdc6, Cdt1 ou do complexo MCM, todos componentes do CPR, durante o ciclo celular. Em tripanosomas, Orc1/Cdc6 interage com o DNA durante todo o ciclo celular e não há seqüência homóloga a Cdt1 no bando de dados de tripanosomas. Assim, parece que o controle da re-replicação nestes organismos esteja centrado nas subunidades do complexo MCM. Portanto, pretendemos avaliar a localização do complexo MCM e sua interação com DNA durante o ciclo celular destes organismos. Finalmente, como o ciclo de vida do Trypanosoma cruzi envolve formas proliferativas e não-proliferativas (infectivas) e como verificamos que Orc1/Cdc6 interage com DNA nas formas proliferativas, mas não nas infectivas, pretendemos analisar as modificações pós-traducionais desta proteína nas diferentes formas a fim de buscar possíveis mecanismos moleculares que garantam a falta de replicação nas formas infectivas destes parasitas. (AU)